植物microRNA響應(yīng)非生物脅迫研究進(jìn)展

吳美婷，楊曉玉，2，羅淋淋，莫蓓莘，劉 琳

（1. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院/廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060；2. 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院/光電子器件與系統(tǒng)（教育部/廣東?。┲攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060）

microRNA （miRNA）是一類長度約為20～24 nt的非編碼小RNA （small non-coding RNA），廣泛分布于各類動(dòng)植物中，在動(dòng)植物基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。成熟miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ（Pol-Ⅱ）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級轉(zhuǎn)錄本（primary-miRNA，pri-miRNA）、經(jīng)過核糖核酸酶DCL1 （DICER-LIKE 1）加工后形成的miRNA/miRNA*雙鏈聚合體而來，并且該過程可受一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［1］。成熟miRNA進(jìn)一步與Argonaute （AGO）蛋白等結(jié)合形成RISC復(fù)合體（RNA-induced silencing complex），通過直接切割靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯，以及通過切割來源于PHAS位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的大量phasiRNA而間接作用于靶基因mRNA，實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)植物的生長發(fā)育進(jìn)程以及逆境響應(yīng)［2-3］。

1993年，研究人員從秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNAlin-4，它是線蟲發(fā)育早期必需的調(diào)控因子。隨后，人們陸續(xù)在其他物種中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的miRNA。其中，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中發(fā)現(xiàn)了325個(gè)miRNA基因，在重要的農(nóng)作物水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）以及園藝作物番茄（Solanum lycopersicum）中則分別發(fā)現(xiàn)了592、172、77個(gè)miRNA基因［4］。這些在植物中報(bào)道的miRNA多數(shù)具有高度的保守性，但同時(shí)呈現(xiàn)出一定的物種間差異性以及時(shí)空表達(dá)特異性，在植物根、莖、葉、花器官和果實(shí)的生長發(fā)育及生物和非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本文綜述了近年來植物miRNA的生物學(xué)特性及其參與非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控方面的研究進(jìn)展，并探討了今后該領(lǐng)域研究的主要發(fā)展方向。

1 miRNA的生物合成、降解及作用方式

1.1 miRNA的生物合成

圖1 miRNA的生物合成、降解及作用機(jī)制

植物miRNA的生物合成是一個(gè)精確而復(fù)雜的過程（圖1）。經(jīng)典的miRNA生物合成是以Pol-Ⅱ作用下miRNA基因轉(zhuǎn)錄形成primiRNA開始，隨后pri-miRNA 折疊成一個(gè)特定的二級莖環(huán)（stem-loop）發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被具有核糖核酸酶活性的DCL1家族成員等形成的蛋白切割復(fù)合體（dicing body）識別并裂解形成70～350 nt的莖環(huán)狀前體（precusor miRNA，pre-miRNA），并在HYL1 （Hyponastic Leaves1）和SE （Serrate）的作用下被進(jìn)一步加工成miRNA/miRNA*復(fù)合體，該二聚體隨后經(jīng)HEN1 （Hua Enhancer1）甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化修飾并在HST （HASTY）蛋白作用下出核，成熟miRNA與AGO蛋白可結(jié)合形成RISC復(fù)合體調(diào)控靶基因的表達(dá)［3-6］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CBP20 （Cap-binding Protein20）和CBP80 （Capbinding Protein80）在miRNA合成過程中發(fā)揮著與SE和HYL1類似的功能，同時(shí)剪接因子RS40和RS41以及RNA結(jié)合蛋白HOS5也直接參與miRNA的合成，并且RNA結(jié)合蛋白SE和HYL1與DCL之間的互作是調(diào)控pri-miRNA加工的重要機(jī)制［3，7-8］。

1.2 miRNA的降解

成熟miRNA的穩(wěn)定性對于其功能的正常發(fā)揮具有重要意義。植物在長期進(jìn)化過程中形成了多種機(jī)制以維持體內(nèi)miRNA水平的穩(wěn)定。HEN1介導(dǎo)的miRNA 3′末端核糖2′-O-甲基化修飾是維持成熟miRNA穩(wěn)定性的重要機(jī)制之一。HEN1是一個(gè)Mg2+依賴型的甲基轉(zhuǎn)移酶，可與DCL1/HYL1/miRNA復(fù)合物結(jié)合，將甲基從輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到雙鏈miRNA分子3′末端核苷酸的2′-OH基團(tuán)上，避免其尿苷酸化和降解。SDN （SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE）蛋白具有3′→5′核酸外切酶的活性，可介導(dǎo)2′-O-甲基化miRNA由3′→5′的降解，限制miRNA在擬南芥中的積累；SDN蛋白的失活可導(dǎo)致miRNA豐度增加和植物發(fā)育異常，離體實(shí)驗(yàn)表明，AGO10結(jié)合的miR165/166對SDN1的作用敏感，AGO10可通過促進(jìn)SDN1和SDN2介導(dǎo)的miR165/166的降解來減少miR165/166在體內(nèi)積累［3］。核苷酸轉(zhuǎn)移酶HESO1 （Hen1 Suppressor1）和URT1 （UTP：RNA Uridylyltransferase1）介導(dǎo)的miRNA的尿苷化降解也是植物體內(nèi)避免成熟miRNA過量積累的重要機(jī)制，HESO1和URT1通過參與miRNA 3′端的加尾影響miRNA的降解和活性；HESO1和URT1均可向未被甲基化修飾miRNA的3′端添加寡聚尿苷酸尾使其降解，但二者對miRNA 3′端核苷酸具有不同的偏好，HESO1優(yōu)先催化3′端以U結(jié)尾的miRNA加尾，而URT1則優(yōu)先催化3′端以A結(jié)尾的miRNA 加尾［8］。

1.3 miRNA的作用方式

圖2 miRNA參與植物生長發(fā)育的調(diào)控

miRNA可通過剪切或者翻譯抑制的方式對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育過程，包括根的形成、莖葉的發(fā)育、花器官的形成、果實(shí)的發(fā)育等（圖2）。miRNA可能調(diào)控一類靶基因家族的多個(gè)靶基因成員，同一類靶基因也可能參與植物的多種生長發(fā)育調(diào)控過程。靶基因mRNA上與miRNA互補(bǔ)的區(qū)域通常被稱作miRNA響應(yīng)元件（miRNA response element，MRE），植物中的MRE大多分布在靶基因的編碼區(qū)以及5′和3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）。當(dāng)miRNA與靶基因mRNA上的MRE完全互補(bǔ)或幾乎完全互補(bǔ)時(shí)，RISC復(fù)合體中的AGO可使靶基因的上MRE與miRNA 序列配對區(qū)域第10～11位核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生裂解，裂解產(chǎn)物隨后進(jìn)一步被核酸外切酶降解。miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，是植物中miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的主要途徑。此外，當(dāng)miRNA與靶基因的MRE序列不完全互補(bǔ)時(shí)，它可通過與靶基因MRE的不完全互補(bǔ)配對進(jìn)而阻抑靶基因mRNA的翻譯過程，該途徑對mRNA的穩(wěn)定性無影響，屬于翻譯水平的基因調(diào)節(jié)，可由靶基因的mRNA與蛋白豐度的不一致所反映，該過程主要發(fā)生在植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，需要AMP1 （Altered Meristem Program1）蛋白參與介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)［9］。

表1 miRNA對植物非生物脅迫的響應(yīng)

2 miRNA參與植物的非生物脅迫應(yīng)答調(diào)控

溫度、光照、水分和礦質(zhì)元素等是植物生長發(fā)育所必需的環(huán)境因子。由于外部環(huán)境因子的多變性，植物常常會(huì)面臨一種或多種不利環(huán)境因子的脅迫，影響正常的生長發(fā)育過程。環(huán)境脅迫分為生物和非生物脅迫，其中非生物脅迫主要是指干旱脅迫、鹽脅迫、高低溫脅迫、養(yǎng)分脅迫以及重金屬脅迫等。在長期的進(jìn)化過程中，植物形成了一系列響應(yīng)各種非生物脅迫的機(jī)制，其中miRNA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)是植物應(yīng)答各種非生物脅迫的重要機(jī)制之一。表1總結(jié)了近年報(bào)道的參與植物非生物脅迫響應(yīng)的主要miRNA。非生物脅迫下，植物可通過調(diào)節(jié)某些miRNA的表達(dá)或者產(chǎn)生一些新的miRNA來調(diào)節(jié)自身對脅迫的耐受性，以便在逆境下得以生存。與動(dòng)物相比，盡管植物中miRNA調(diào)控的靶基因在全部基因中所占比重較低，但由于這些靶基因大多為轉(zhuǎn)錄因子，因此miRNA參與的植物逆境響應(yīng)機(jī)制更為復(fù)雜。

2.1 干旱脅迫

干旱是世界性的生態(tài)危機(jī)，也是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫之一，闡明植物的耐旱機(jī)制、培育耐旱品種、提高水資源的利用率是今后農(nóng)業(yè)科研中亟需解決的問題。在擬南芥中，miR156、miR159、miR160、miR165、miR169、miR171、miR319、miR394和miR395等均可響應(yīng)干旱脅迫，且干旱脅迫程度不同，miRNA的響應(yīng)趨勢亦存在差異［11］。干旱脅迫下，脅迫敏感水稻的旗葉中 miR159f、miR397、miR398b、miR408-3p、miR528-5p、amiR1871和 miR2878-5p的表達(dá)量顯著下調(diào)，而脅迫鈍感水稻的上述7類miRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明這些miRNA可能在水稻耐旱性的調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［32］。植物的miRNA對干旱脅迫的響應(yīng)可通過調(diào)控ABA （Abscisic Acid）依賴型靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)［18］。植物體內(nèi)部分miRNA基因如擬南芥miR167和miR393等的啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA信號途徑的響應(yīng)元件（ABA-response elements，ABREs），可直接響應(yīng)干旱脅迫下ABA信號途徑的變化，進(jìn)而影響下游靶基因如生長素受體基因TIR1/AFB2 （Transport Inhibitor Response/Auxin Signaling F-Box2）和生長素響應(yīng)因子ARF8 （auxin response factor8）等的表達(dá)，調(diào)控植物的生理生化過程及生長發(fā)育進(jìn)程來適應(yīng)外部環(huán)境中的水分供應(yīng)不足［33］。ABA亦可通過miR159介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子如MYB101和MYB33的降解來調(diào)控植物對干旱脅迫的適應(yīng)［33］。miRNA介導(dǎo)的ABA非依賴型靶基因表達(dá)的調(diào)控也是植物干旱脅迫響應(yīng)的重要機(jī)制。干旱脅脅迫下，植物體可產(chǎn)生大量的乙烯，繼而激活乙烯信號通路蛋白基因EIN2 （Ethylene Insensitive2），抑制miR164的表達(dá)并促進(jìn)其下游靶基因NAC1 （Nucleus Accumbens-Associated1）和ORE1 （Oresara1）等的表達(dá)，加速葉片衰老，降低植株的蒸騰作用，提高植物的保水及耐旱性［33］。此外，miR408還可通過調(diào)控質(zhì)藍(lán)素等銅結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而引起DREB（Dehydration Responsive Element Binding）和其他干旱響應(yīng)基因的差異表達(dá)，提高植物的耐旱性［32］。

綜上，多種miRNA可參與植物對干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控，進(jìn)而影響其耐旱性，然而與目前所鑒定出的大量響應(yīng)干旱脅迫的miRNA相比，進(jìn)行功能驗(yàn)證的miRNA數(shù)量仍相對較少，對其進(jìn)行深入研究將有助于我們更好地理解干旱脅迫下miRNA參與響應(yīng)的具體分子機(jī)制。

2.2 鹽脅迫

植物體內(nèi)多個(gè)miRNA介導(dǎo)的調(diào)控途徑均可響應(yīng)鹽脅迫。鹽脅迫下擬南芥中miR156、miR158、miR159、miR161、miR165、miR167、miR168、miR169、miR171、miR173、miR319、miR393、miR394、miR396和 miR397的表達(dá)上調(diào)，而miR398的表達(dá)則顯著降低［21］。Sun等［12］研究了大豆根尖分生組織中miRNA對鹽脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)miR156g、miR156j、miR172f、miR390e、miR399a、miR1511、miR2111b、miR2111c和miR2111f參與了大豆根系耐鹽性的調(diào)控。水稻miRNA對鹽脅迫的響應(yīng)具有明顯的品種間差異，在抗鹽水稻品種中miR156j、miR390和miR5817等的表達(dá)受到顯著抑制，而miR168a和miR535-5p等的表達(dá)則顯著升高；然而在鹽敏感品種中上述miRNA的表達(dá)則呈現(xiàn)截然相反的趨勢［34］。鹽脅迫下桑樹（Morus alba）有12個(gè)miRNA的表達(dá)與正常生長條件下相比具有顯著差異，其中表達(dá)量顯著上升的有novel-19*、novel-68、miR398a和 miR408，而 novel-6ae、novel-50、novel-65、miR394*、miR395、miR395*、miR827和miR2111的表達(dá)則顯著下降［35］。除了轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)，miRNA轉(zhuǎn)錄后的加工過程亦可對鹽脅迫發(fā)生響應(yīng)，從而影響成熟miRNA在植物體內(nèi)的積累。研究表明，鹽脅迫下盡管成熟miR161和miR173的豐度顯著上升，但是其初級轉(zhuǎn)錄本的水平卻呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢［36］，這種不一致性可能是由鹽脅迫下AGO1對兩個(gè)miRNA在胞質(zhì)及核內(nèi)的差異調(diào)控所致，首先在胞質(zhì)內(nèi)AGO1可與miRNA形成RISC復(fù)合體，提高miRNA的穩(wěn)定性，而在細(xì)胞核內(nèi)，AGO1則可結(jié)合于基因組中miRNA基因莖環(huán)結(jié)構(gòu)的編碼區(qū)域，抑制miRNA基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致miRNA初級轉(zhuǎn)錄本豐度的下降［37］。此外，miRNA還可通過影響生長素信號途徑參與植物對鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫可誘導(dǎo)擬南芥miR393的表達(dá)，進(jìn)而抑制TIR1和AFB2的表達(dá)，激發(fā)體內(nèi)的鹽脅迫響應(yīng)途徑，提高擬南芥的耐鹽性，這與擬南芥tir1/afb2 雙突變體的耐鹽性顯著提高的研究結(jié)果一致［19］。

盡管目前已鑒定出多種植物的大量miRNA均可響應(yīng)鹽脅迫，但除少量miRNA調(diào)控機(jī)制的研究較為透徹以外，多數(shù)miRNA參與介導(dǎo)的鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控機(jī)制仍不清楚，有必要在今后工作中進(jìn)一步研究。

2.3 高溫與低溫脅迫

由于地理?xiàng)l件的差異以及季節(jié)的變化，植物在生長發(fā)育過程中常常面臨各種極端的溫度條件，這對植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成極為不利。Li等［38］利用高通量測序技術(shù)研究了褪黑素緩解冷脅迫對西瓜（Citrullus lanatus）傷害過程中miRNA的變化，發(fā)現(xiàn)有50個(gè)miRNA的表達(dá)響應(yīng)褪黑素處理呈顯著上調(diào)或下調(diào)趨勢，其中部分下調(diào)miRNA的靶基因可參與逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或者對植物具有保護(hù)和解毒功能，mRNA-seq結(jié)果顯示這些靶基因在褪黑素處理下表達(dá)量均顯著提高，表明miRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能參與了褪黑素對西瓜耐寒性的調(diào)控。水稻的miRNA可通過CBF（C-repeat binding transcription factor）依賴的途徑來調(diào)節(jié)其耐寒性，其中miR319的表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)其靶基因PCF5 （Proliferating Cell Factor5）、PCF6、PCF8和TCP21的表達(dá)，繼而激活冷應(yīng)激基因DREB1A/1B/1C和DREB2A，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，增強(qiáng)水稻的耐寒性；而miR394和miR397則是水稻耐寒性的正調(diào)控因子［20］。

miRNA可參與植物對高溫脅迫的響應(yīng)，但表現(xiàn)出明顯的種間差異。例如在高溫脅迫下小麥（Triticum aestivum）的miR160、miR166和 miR167表達(dá)量顯著上升［17］，而毛白楊（Populus tomentosa） miR160的表達(dá)則顯著下降［13］。Liu 等［17］檢測了不同品種水稻 miRNA對高溫脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)miR159a.1、miR159b和miR528-3p的表達(dá)在高溫耐受型品種中受到抑制，但在敏感品種中被誘導(dǎo)；然而miR396e-5p和miR396f-5p的表達(dá)在高溫耐受型品種中顯著上調(diào)，但在高溫敏感品種中表達(dá)則顯著下調(diào)；此外，miR164d、miR166i-3p、miR168a-3p和miR397b在高溫脅迫處理后，無論是耐受型還是敏感型品種其表達(dá)量均呈顯著降低的趨勢。與野生型相比，過表達(dá)小麥miR159的轉(zhuǎn)基因水稻對高溫處理更敏感［14］，表明高溫處理小麥中miR159的下調(diào)可能參與高溫響應(yīng)相關(guān)的信號通路，從而提高了小麥的耐熱性。miR173-TAS1-HTT（heat-induced TAS1target）-HSF（heat stress transcription factors）和miR398-CSD（Copper/Zinc Superoxide Dismutase1） /CCS（Copper Chaperone For Sod1）-HSF途徑是目前研究較為清楚的植物參與熱應(yīng)激反應(yīng)的重要途徑。其中，miR173-TAS1可在熱脅迫下被抑制，繼而其下游熱脅迫響應(yīng)基因HTT1和HTT2高度表達(dá)，促進(jìn)HSF基因的表達(dá)及積累，提高植物的耐熱性；不同于miR173，miR398是通過HSP （heat shock protein）的積累來感應(yīng)熱脅迫，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游靶基因CSD1、CSD2和CCS的表達(dá)，影響植物體內(nèi)ROS （Roactive Oxygen Species）的積累和耐熱性［39］。

盡管越來越多的證據(jù)表明miRNA在植物響應(yīng)極端溫度脅迫時(shí)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但目前對其具體的調(diào)控機(jī)制仍有許多不明之處，需要在今后研究中逐步解析，并應(yīng)用于農(nóng)作物的遺傳改良中。

2.4 養(yǎng)分脅迫

礦物元素如氮、磷和硫等是植物生長、發(fā)育和產(chǎn)量形成所必需的營養(yǎng)元素。Ren等［18］利用小RNA測序分析了低氮脅迫下毛果楊（Populus trichocarpa）中miRNA表達(dá)的變化，鑒定出7個(gè)保守miRNA家族（miR159a/b、miR160e-3p、miR166a-m、miR169a/b-5p/c、miR172a/b-3p/c/f、miR396c/d/e-5p和 miR475a-3p/b-3p）和 1個(gè)毛果楊特有miRNA （miR6427-3p）的表達(dá)顯著降低，而3個(gè)miRNA家族（miR395b-k、miR396a/b和miR396e-3p）的表達(dá)則顯著上升，表明miRNA在植物氮響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。與正常供氮條件下的植株相比，低氮脅迫處理的菊花（Chrysanthemum morifolium）根系中有28個(gè)miRNA上調(diào)，53個(gè)下調(diào)；而在葉片中則有40和61個(gè)miRNA 分別呈現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)的趨勢，其中低氮脅迫下miR169a的下調(diào)可促進(jìn)NFYA（Nuclear Transcription Factor-Y Alpha） 基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)菊花對低氮環(huán)境的適應(yīng)［24］，這與擬南芥中的研究結(jié)果一致［40］，暗示miR169a-NFYA參與的低氮適應(yīng)機(jī)制在高等植物中可能具有一定的保守性。miRNA對植物氮信號途徑成員的調(diào)控可能是其響應(yīng)氮脅迫的重要機(jī)制之一。在氮信號途徑中，生長素受體AFB3受到氮信號和miR393的雙重調(diào)控，其中氮信號表現(xiàn)為正調(diào)控，而miR393則負(fù)調(diào)控AFB3的表達(dá)，當(dāng)?shù)毓?yīng)異常時(shí)，AFB的表達(dá)呈現(xiàn)為氮信號及miR393共調(diào)控的結(jié)果，隨后經(jīng)生長素信號途徑中的Aux/IAA以及ARF等的傳遞，最終影響植物的NAC4和OBP4基因表達(dá)，調(diào)控植物對氮脅迫的適應(yīng)性［41］。

無機(jī)態(tài)磷是一種十分重要的礦質(zhì)元素，是植物能量供給、遺傳物質(zhì)構(gòu)成所必須的，缺磷可導(dǎo)致植物根系形態(tài)建成的異常，影響植物的正常生長發(fā)育［54］。植物的miR399是最早發(fā)現(xiàn)的與體內(nèi)磷代謝相關(guān)的miRNA，可靶向磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和泛素連接酶基因，在維持磷的平衡上起著重要作用。低磷脅迫下玉米幼苗根系中12個(gè)miRNA的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中2個(gè)屬于保守的miRNA家族（miR156和miR399b），其余10個(gè)為禾本科特有的miRNA，其中miR399b和玉米特有的miR3具有共同的靶基因磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PT1 （Phosphate Transporter1）和PT2［10］，暗示miR399b和miR3可能直接參與玉米磷酸鹽代謝調(diào)節(jié)。水稻miR399在低磷脅迫下表達(dá)量下調(diào)，從而抑制LTN1 （Leaf Tip Necrosis1）的表達(dá)，激活多種營養(yǎng)吸收相關(guān)基因如PTs（phosphate transporters）和磷饑餓誘導(dǎo)基因PSIGs（phosphate starvation-inducible genes）的表達(dá)，提高水稻對低磷脅迫的耐受性［42］。缺磷脅迫下，擬南芥的miR399表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)編碼泛素E2結(jié)合酶的PHO2 （PHOSPHATE2）mRNA的切割；時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果顯示芽中miR399對缺磷脅迫的響應(yīng)早于根［43］，這可能與miR399可作為信號分子進(jìn)行長距離運(yùn)輸有關(guān)，但具體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制目前仍不清楚。磷饑餓下大豆根系和葉片中的miR169f、miR399a、miR399b、miR399c和miR399d等25個(gè)miRNA受到誘導(dǎo)，且葉中的表達(dá)水平顯著高于根中；而miR169c和miR169r等11個(gè)miRNA的表達(dá)則被抑制［23］。miR156-SPL3 （Squamosa-Promoter Binding Protein-Like3）-Pht1.5/PLDZ2（phospholipase DZ2）/miR399f和MYB2-miR399f通路是植物低磷脅迫響應(yīng)調(diào)控機(jī)制的重要組成部分。首先，低磷條件下擬南芥PHR1可促進(jìn)miR156的表達(dá)，從而抑制其下游靶基因SPL3的表達(dá)，而SPL3則能通過結(jié)合啟動(dòng)子中的GATC元件對PLDZ2、Pht1.5和miR399f進(jìn)行調(diào)控，調(diào)節(jié)擬南芥的低磷耐受性［44］，此外，擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子MYB2和miR399f可在相同組織中表達(dá)，MYB2可直接結(jié)合到miR399f 啟動(dòng)子中的MYB結(jié)合位點(diǎn)并正向調(diào)節(jié)miR399f的表達(dá)，磷饑餓處理可誘導(dǎo)MYB2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)miR399f的表達(dá)以維持體內(nèi)磷代謝的穩(wěn)定；過表達(dá)MYB2可導(dǎo)致擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的根系形態(tài)建成異常［45］。Lin 等［31］通過 Northern blot和原位雜交實(shí)驗(yàn)分析了低磷脅迫下水稻miR827的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)磷饑餓處理可顯著提高miR827在水稻葉肉、表皮和根中的表達(dá)，同時(shí)其靶基因SPX（SYG1/PHO8/XPR1）-MFS1 （Major Facility Superfamily1）的表達(dá)顯著減少；而其靶基因SPX-MFS2 mRNA的積累在磷饑餓下則顯著增強(qiáng)，反映了水稻miR827與其兩個(gè)靶基因參與磷代謝調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

植物可吸收環(huán)境中的無機(jī)硫元素并進(jìn)一步同化為有機(jī)態(tài)硫，并以甲硫氨酸和半胱氨酸的形式參與一系列的生物及化學(xué)過程，因此在全球硫循環(huán)中發(fā)揮著極為重要的橋梁作用。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中miR156、miR160、miR164、miR167、miR168、miR394和 miR395的表達(dá)在低硫脅迫下均發(fā)生了變化［46］。低硫環(huán)境可通過促進(jìn)擬南芥硫同化途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SLIM1（Sulfur Limitation1）的表達(dá)，促進(jìn)根和葉中的miR395的表達(dá)，與此同時(shí)，APS1 （ATP Sulfurylse1）、APS4和芽中SULTR2.1 （Sulfate Transporter2.1）的表達(dá)均發(fā)生了下調(diào)，而APS3和根系中SULTR2.1的表達(dá)卻呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢，組織特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，miR395主要在韌皮部伴胞中表達(dá)，而SULTR2.1主要在木質(zhì)部的薄壁細(xì)胞中表達(dá)［46］，這種表達(dá)的空間異位可能有利于硫元素通過木質(zhì)部從根系向芽中的轉(zhuǎn)運(yùn)。Yuan等［28］克隆了一個(gè)來自水稻的miR395基因并研究了其對植物營養(yǎng)脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明硫缺乏可誘導(dǎo)水稻miR395的表達(dá)及兩個(gè)靶基因表達(dá)的下調(diào)；過表達(dá)水稻miR395h的轉(zhuǎn)基因煙草中，硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SULTR2的表達(dá)受到抑制，打破了硫酸鹽代謝的平衡，并對不同時(shí)期葉片中硫酸鹽的分配產(chǎn)生了影響。

隨著研究的逐步深入，越來越多營養(yǎng)脅迫響應(yīng)相關(guān)miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，由其介導(dǎo)的響應(yīng)調(diào)控機(jī)制也開始逐步被解析，這為作物營養(yǎng)特性的遺傳改良工作提供了更多的思路，并可促進(jìn)減肥增效工作的開展以及綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

2.5 金屬離子脅迫

miRNA在植物響應(yīng)重金屬脅迫中發(fā)揮著重要作用。鎘毒害嚴(yán)重影響植物正常的生長發(fā)育，危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。Qiu等［16］研究了鎘脅迫下小麥miRNA表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)根系和葉片中miR159、miR408以及根系中miR398與其對應(yīng)的靶基因MYB3、CLP（Cardiac Lineage Protein）和CSD（N-Chlorosulfonyl Dicyclohexylamine）的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明miRNA可能參與小麥對鎘脅迫響應(yīng)的調(diào)控。鎘脅迫下水稻成熟miR390的豐度顯著降低，而其靶基因SRK（Serine/Threonine-Protein Kinase）的表達(dá)則明顯升高；與野生型相比，過表達(dá)miR390的轉(zhuǎn)基因水稻SRK的表達(dá)被顯著抑制，對鎘脅迫的耐受性降低［26］，暗示miR390可能是水稻耐鎘性的負(fù)調(diào)控因子之一。與野生型油菜（Brassica napus）相比，過表達(dá)miR395可抑制鎘由根系向到芽的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)金屬耐受型基因如PCS1 （Phytochelatin Synthases1）、HO1（Heme Oxygenase1）和SULTR1.1的表達(dá)上調(diào)，顯著提高了對鎘脅迫的耐受性，從而使產(chǎn)量增加［47］。

miRNA在植物對鋁脅迫的響應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Lima等［22］檢測了鋁脅迫下粳稻和秈稻根系miRNA表達(dá)量的變化，鑒定出粳稻根中有19個(gè)miRNA響應(yīng)鋁脅迫，而在秈稻根中僅有8個(gè)，其中miR393b、miR395a、miR398a、miR398b和miR408在粳秈稻中均表現(xiàn)為下調(diào)，miR168a、miR399和miR528均為上調(diào)，暗示miRNA介導(dǎo)的鋁脅迫響應(yīng)調(diào)控機(jī)制在水稻中具有一定的保守性。Burklew等［29］研究發(fā)現(xiàn)煙草中miR395、miR397、miR398和miR399的表達(dá)在鋁脅迫下顯著增加；Zeng等［48］以鋁脅迫處理的大豆幼苗根系為試材構(gòu)建了小RNA和降解組文庫并利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行了分析，鑒定出30個(gè)響應(yīng)鋁脅迫的miRNA及其下游調(diào)控的靶基因68個(gè)。植物的miR393-TIR1/AFB途徑是鋁毒害下調(diào)控根系生長的重要機(jī)制之一。首先，鋁脅迫可導(dǎo)致大麥中miR393的表達(dá)下調(diào)，繼而提高了其靶基因TIR1/AFB的表達(dá)，促進(jìn)了根尖中的生長素信號傳導(dǎo)，抑制根的伸長；其次，鋁脅迫也可能促進(jìn)局部生長素的生物合成或極性運(yùn)輸，有助于提高根尖對生長素變化的響應(yīng)以及脅迫環(huán)境的適應(yīng)［27］。

銅元素既是植物的必需營養(yǎng)元素，也是一類重要的重金屬污染物。菜豆（Phaseolus vulgaris）的miR398b和靶基因CSD1和Nod19（Nodulation19） 在根、根瘤及葉片中表達(dá)，并可響應(yīng)銅虧缺與毒害兩種逆境，表明miR398b對維持菜豆體內(nèi)銅元素的穩(wěn)態(tài)具有重要的調(diào)控作用；過表達(dá)miR398的轉(zhuǎn)基因菜豆和煙草中CSD1和Nod19的表達(dá)受到抑制，銅毒害等脅迫條件下ROS大量產(chǎn)生，植物抗性降低［30］。然而，目前關(guān)于miR398其他家族成員在響應(yīng)銅脅迫中的功能尚不清楚，miR398在其他植物中是否參與對銅脅迫的響應(yīng)還有待驗(yàn)證。Liu等［15］利用高通量測序技術(shù)分析了銅脅迫下蘿卜中miRNA的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，有54個(gè)已知和16個(gè)新型miRNA在銅脅迫下的表達(dá)差異顯著，其靶基因多為轉(zhuǎn)錄因子如SPLs、MYBs、ERFs（Ethylene-Responsive Transcription Factors）和bZIPs（Basic Leucine Zippers）等，可進(jìn)一步調(diào)控銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMAs（Heavy Metal ATPases）、YSLs（Yellow Stripe-like1Transporter）和ABCs（ATP-Binding Cassette-Transporters）的表達(dá)，影響銅的吸收和體內(nèi)的平衡。轉(zhuǎn)錄因子SPL7在miRNA對銅脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要的橋梁作用。首先銅缺乏可促進(jìn)SPL7的表達(dá)，繼而通過結(jié)合于銅脅迫響應(yīng)miRNA基因如miR397a、miR398b/c和miR857以及銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因COPT1 （copper transporter1）、COPT2和COPT6啟動(dòng)子的GATC順式作用元件上，誘導(dǎo)其表達(dá)并抑制miRNA靶基因的轉(zhuǎn)錄，提高植物對銅離子的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)；相反，銅毒害會(huì)導(dǎo)致SPL7失活，受SPL7轉(zhuǎn)錄激活的miRNA以及銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等的表達(dá)下調(diào)，降低銅的吸收，提高植物對銅毒害的耐受性［49］。此外，錳脅迫可誘導(dǎo)大豆菌根中miR172的表達(dá)顯著升高，進(jìn)而抑制其靶基因AP2的表達(dá)，暗示miRNA 亦可參與植物對錳脅迫響應(yīng)的調(diào)控［50］。

目前土壤的重金屬污染問題呈逐漸加重的趨勢，miRNA作為一類重要的調(diào)控因子，在植物的重金屬脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，隨著其調(diào)控機(jī)制的逐步闡明、基因操控技術(shù)的革新，對miRNA及其調(diào)控途徑進(jìn)行操控可能成為改善植物對重金屬脅迫耐受性的重要途徑，服務(wù)于重金屬污染土壤的利用。

2.6 其他非生物脅迫

miRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也可響應(yīng)機(jī)械傷害、氧化及缺氧等其他形式的非生物脅迫。例如，機(jī)械脅迫下毛果楊22個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，其靶基因多為發(fā)育和脅迫相關(guān)的基因，這與毛果楊在機(jī)械脅迫下的適應(yīng)性生長具有高度地一致性［48］。在水稻中，miR169、miR397、miR827和miR1425 的表達(dá)水平在高H2O2條件下顯著升高，而miR172則顯著降低［52］；過表達(dá)OsmiR529的水稻可通過抑制其靶基因OsSPL2/OsSPL14的表達(dá)，激活下游活性氧清除酶類如SOD（Superoxide Dismutase）、POD（Peroxidase）等的表達(dá)，提高植物對氧化脅迫的耐受性［53］，表明miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與氧化脅迫具有一定的關(guān)聯(lián)性。

3 展望

3.1 植物miRNA的代謝

自20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過20多年的發(fā)展，植物miRNA領(lǐng)域的研究取得了長足進(jìn)步，大量有關(guān)植物miRNA生物合成、降解以及作用機(jī)制的研究揭示了miRNA在植物體內(nèi)主要的代謝途徑，對該途徑中更多關(guān)鍵因子的克隆和功能鑒定將使得人們對miRNA代謝通路的認(rèn)識更加完整和清晰。但有關(guān)miRNA代謝過程發(fā)生的具體亞細(xì)胞定位還有待進(jìn)一步探討，如AGO1蛋白如何在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行分配和執(zhí)行功能？蛋白切割復(fù)合體如何在細(xì)胞核內(nèi)形成和行使切割功能？miRNA介導(dǎo)的靶基因切割發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的什么位置？同時(shí)，目前對于植物miRNA在翻譯水平調(diào)控的靶基因的鑒定及分子機(jī)制研究仍相對匱乏，有待進(jìn)一步深入探討揭示其具體過程和發(fā)生機(jī)理。以上這些問題的闡明將有助于我們深入理解miRNA在植物體內(nèi)的作用機(jī)制。

3.2 植物miRNA的生物學(xué)功能

目前植物miRNA的研究主要集中在以擬南芥和水稻等為代表的模式植物上，對于其他重要農(nóng)作物的研究仍相對匱乏，特別是物種特異的miRNA有待被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。其次，多數(shù)miRNA功能的研究仍以過表達(dá)或者基因沉默技術(shù)為主，缺乏相關(guān)的突變體證據(jù)，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)將有效解決這一問題，幫助獲得大量定點(diǎn)定向突變體，豐富實(shí)驗(yàn)資源。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)除了成熟的miRNA，miRNA*在特定脅迫中也發(fā)生了明顯的表達(dá)量變化，表明其參與非生物脅迫響應(yīng)并發(fā)揮一定的作用，今后對于miRNA*的研究工作也將很有意義。miRNA在加工過程中會(huì)發(fā)生堿基替換、缺失或增加等修飾，這些修飾廣泛存在于多種作物中并可能參與調(diào)控作物的生長發(fā)育和逆境應(yīng)答，研究miRNA的修飾將為理解miRNA的作用機(jī)制和功能提供新的思路。

3.3 植物miRNA參與逆境脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制

盡管很多研究揭示了miRNA與逆境脅迫的相關(guān)性，但關(guān)于miRNA對逆境脅迫調(diào)控的分子機(jī)理尚不清晰，且仍有大量與逆境相關(guān)的miRNA及其靶基因尚未被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)一種miRNA可能具有多重作用，在多種非生物脅迫調(diào)控途徑中發(fā)揮作用，因此有必要深入發(fā)掘逆境相關(guān) miRNA，揭示其靶基因，解析miRNA介導(dǎo)的逆境脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些研究可豐富植物逆境生物學(xué)的理論知識，并為農(nóng)作物的遺傳改良提供技術(shù)支撐，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

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