利用基因芯片技術(shù)解析海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠糖脂代謝的調(diào)控

董麗莎，李妍妍，張紅燕，崔晨茜，韓姣姣，王朝陽(yáng)，司開學(xué)，周 君，蘇秀榕,*

糖尿病是一種由于胰島素抵抗（insulin resistance，IR）伴有相對(duì)胰島素不足或胰島素分泌缺陷而導(dǎo)致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝型疾病，是在遺傳和環(huán)境的共同作用下發(fā)生的一種慢性代謝性異常。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，生活方式的改變和社會(huì)人口老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題，也成為世界各國(guó)致死、致殘并造成醫(yī)療開支增高的主要原因。糖尿病以慢性血糖水平增高為特征，長(zhǎng)期的高血糖可使一些組織或器官發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，導(dǎo)致多系統(tǒng)損害和各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。

在糖尿病各種慢性并發(fā)癥中，糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是最常見的并發(fā)癥之一。DN的病理生理機(jī)制目前為止仍然不是十分清楚，總地來說是復(fù)雜的多因素作用的結(jié)果，包括遺傳、氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物的沉積、血流動(dòng)力學(xué)改變等。迄今為止，針對(duì)DN的防治手段仍然集中于代謝危險(xiǎn)因素的控制（如嚴(yán)格控制血糖、血壓、血脂水平）、戒煙、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的應(yīng)用等。然而上述治療方法并不能完全阻斷DN的發(fā)展。因此有必要尋求新的治療方法阻止或延緩DN的發(fā)生和發(fā)展。綜上，開展研制新型藥物，在積極控制血糖的同時(shí)，關(guān)注并加強(qiáng)對(duì)DN的干預(yù)和治療有著極為重要的意義[1-2]。

自古以來，海參就是保健食品和營(yíng)養(yǎng)食品。明代《食草本草》中指出海參有主補(bǔ)元?dú)?、滋養(yǎng)五臟六腑和祛虛損的養(yǎng)生功能[3]。清代《本草綱目適遺》中藥典籍則將海參列為補(bǔ)益藥物[4]，其載“海參性溫補(bǔ)，足敵人參，故名海參。其味甘咸，補(bǔ)腎經(jīng)，益精髓，精痰延，攝小便，壯陽(yáng)療痿，殺瘡蟲”。近年來先后有中醫(yī)提出以海參單用后組方治療腫瘤[5]、貧血[6]和糖尿病[7]，取得了良好的效果。海參具有很高的藥用價(jià)值，主要是由于海參中含有多種生理活性物質(zhì)[8]。

海地瓜（Acaudina molpadioide）屬棘皮動(dòng)物門（Echinodermate）海參綱（Holothuroidea），芋參目（Molpadida）尻參科（Caudinidae），主要分布在我國(guó)沿海海域，資源豐富。海地瓜在近幾年中逐漸被研究開發(fā)，有關(guān)它的研究資料較少，但有文獻(xiàn)報(bào)道其和營(yíng)養(yǎng)成分及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的梅花參相似[9]。海地瓜酶解液主要有降血脂[10-11]、抗氧化[12]、促進(jìn)人皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)和膠原蛋白的合成[13]等作用。

本實(shí)驗(yàn)以高血糖和高血脂癥為特點(diǎn)的自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠為研究對(duì)象，研究了海地瓜酶解液對(duì)其糖代謝與脂代謝的影響，并利用基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

瘦素基因敲除db/db小鼠，體質(zhì)量（36.0±2.0）g，雄性，40 只；db/m（25.0±1.0）g，雄性，10 只（合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，編號(hào)：2007000528007）；實(shí)驗(yàn)鼠全價(jià)顆粒飼料，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

海地瓜酶解液為實(shí)驗(yàn)室自制[14]。

小鼠基因表達(dá)譜芯片和雜交試劑 美國(guó)Agilent公司；總RNA提取Trizol試劑 美國(guó)Invitrogen公司；mRNA純化試劑盒 美國(guó)Promega公司。SYBR Premix ExTaqII試劑盒、pMD18-T載體 日本TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 加拿大BioBasic公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海依科賽生物制品有限公司；血糖、尿糖試劑盒 南京建成生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒寧波溢美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LuxScanTM10K-A雙通道激光共聚焦掃描儀 北京博奧生物有限公司；5424/5424R臺(tái)式高速離心機(jī)、5331 PCR儀 德國(guó)艾本德股份公司；7170型自動(dòng)生化分析儀日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前全部小鼠適應(yīng)飼喂1 周，稱體質(zhì)量并分組。10 只db/m小鼠為空白對(duì)照（C）組；瘦素基因敲除雄性db/db小鼠40 只，按空腹體質(zhì)量隨機(jī)分成模型（M）組、陽(yáng)性藥（Me）組（9.75 mg/kg甲基巴多索隆）、海地瓜酶解液低劑量（APG1）組（10 mg/kg海地瓜酶解液）、高劑量（APG2）組（60 mg/kg海地瓜酶解液），每組10 只[15]。甲基巴多索隆已用于2型糖尿病治療4 期[16]?？瞻讓?duì)照組與模型組灌以等量去離子水。實(shí)驗(yàn)期間，各組自由進(jìn)食、飲水，室溫保持25 ℃左右，光照晝夜間隔12 h，給藥時(shí)間為12 周。實(shí)驗(yàn)期間檢測(cè)小鼠尿糖和血糖濃度。

1.3.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 行為觀察和尿液收集

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察小鼠毛色、神態(tài)、攝食量和行為活動(dòng)等。

每2 周對(duì)小鼠禁食禁水，單只置于代謝籠中收集12 h尿液，記錄尿量，800 r/min離心5 min，取上清液分裝，凍存于-80 ℃冰箱中。解凍后用于尿糖濃度等指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2.2 尿糖濃度的測(cè)定

參照試劑盒說明書測(cè)定。

1.3.2.3 空腹血糖濃度測(cè)定

每2 周，小鼠禁食12 h，眼內(nèi)眥靜脈取血，測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）濃度，記錄血糖值隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)的變化。

1.3.2.4 葡萄糖耐量曲線的繪制

末次給藥后，用葡萄糖按0.5 g/kg mb的量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，分別在0.0、0.5、1.0、2.0 h內(nèi)眼內(nèi)眥靜脈取血，檢測(cè)血清中血糖濃度，繪制葡萄糖耐量曲線[17]。

1.3.3 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 GSP、HbA1c水平的測(cè)定

末次給藥后，各組小鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%戊巴比妥鈉（小鼠每千克體質(zhì)量攝入的量為25 mL）麻醉，腹主動(dòng)脈采血，取800 μL全血用四元羧酸乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，3 500 r/min離心15 min，制得血漿，采用試劑盒測(cè)定糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）和糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）[18]水平。

1.3.3.2 血脂水平測(cè)定

取全血于37 ℃水浴30 min，1 500 r/min離心10 min，分離得到上清液，制得血清，-20 ℃凍存，TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的測(cè)定按照試劑盒說明書于7170型自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行[19-20]。

1.3.3.3 胰島素水平的測(cè)定

采用雙抗體夾心ELISA法，測(cè)定小鼠血清中胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）的水平，并分別按公式（1）、（2）計(jì)算血清胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment，HOMA-IR）與血清胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitive index，ISI）。

式中：FBG為空腹血糖濃度/（mmol/L）；FINS為空腹胰島素水平/（mIU/L）。

1.3.4 基因芯片的檢測(cè)

1.3.4.1 RNA的抽提與探針的制備

取液氮保存的小鼠腎臟組織100 mg徹底碾碎成粉末后，用Trizol一步法提取腎臟組織中的總RNA，經(jīng)異丙醇沉淀法將RNA進(jìn)行濃縮，進(jìn)一步采用Nucleo Spin?RNA clean-up試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行過柱純化后，采用分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

每5 只小鼠為一組，進(jìn)行總RNA等量混合，通過試劑盒進(jìn)行純化后，取2 μg mRNA為模板，以T7 Oligo（dT）Primer為引物，在CbcScript酶的作用下合成第1條cDNA，并加外標(biāo)。用RNase H將雜合鏈中的RNA切成短片段，用DNA聚合酶以所得RNA短片段為引物進(jìn)行延伸，合成第2條cDNA，并對(duì)cDNA進(jìn)行純化。以cDNA為模板，使用T7試劑盒合成cRNA，利用試劑盒進(jìn)行純化。取2 μg cRNA，在CbcScriptⅡ酶作用下隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物利用試劑盒純化。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品，以隨機(jī)引物，用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP、Klenow酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記產(chǎn)物后進(jìn)行純化，抽干。

1.3.4.2 雜交與清洗

標(biāo)記的DNA溶于80 μL雜交液中（3×檸檬酸鈉緩沖液（saline sodium citrate，SSC）、0.2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、5×Denhardt’s溶液、25%甲酰胺），于42 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42 ℃含0.2% SDS、2×SSC的液體中洗5 min，而后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

1.3.4.3 掃描和數(shù)據(jù)分析

用雙通道激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描。在芯片上每個(gè)基因重復(fù)3 次，熒光交換后每個(gè)基因重復(fù)6 次，用LuxScan3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取，用t檢驗(yàn)法來挑選差異基因。對(duì)每個(gè)掃描信號(hào)的Lowess歸一化的比率值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，刪除熒光信號(hào)弱的基因（保留信號(hào)值不小于800的表達(dá)基因和400～800的臨界表達(dá)基因的信號(hào)值）以及芯片上的陰性對(duì)照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余的數(shù)據(jù)，從剩下的基因中挑選至少有4 次Ratio值的基因進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)算得到的t值如果大于0.05，則表明該基因在95%的水準(zhǔn)上為差異表達(dá)。最后挑選差異表達(dá)基因用SAM軟件進(jìn)行分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率控制在5%以內(nèi)，再以1.5 倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因進(jìn)行片間校正和片內(nèi)歸一化及信號(hào)可信度P值分析、GO Terms和Pathway Miner分析。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)

總RNA的提取與cDNA的合成參照基因芯片檢測(cè)中的RNA的提取與探針的制備[21-22]。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR檢測(cè)使用的引物，以16S rRNA作為內(nèi)參基因。選取12 個(gè)基因β-actin、ntrK1、slc2A4、aqp5、aldH1a3、bcaT1、ubd、akr1B3、slc7A13、nupR1、hdc、ptpN5對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成特異性引物，如表1所示。20 μL反應(yīng)體系：2 μL cDNA，0.8 μL上、下游引物，10 μL SYBR，用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件為：92 ℃ 5 min，1 個(gè)循環(huán)；92 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行最小顯著性差異兩兩比較，檢驗(yàn)顯著性水平P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的行為變化

空白對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，飲食、飲水及尿量正常，皮膚有光澤，且體質(zhì)量不斷增加；與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)“三多一少”癥狀，實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)體毛枯黃、稀疏，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍癥狀；各給藥組整體情況明顯優(yōu)于模型組，各種癥狀減輕，糖脂代謝紊亂癥狀得到有效的改善。

2.2 海參酶解液對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖及尿糖濃度的影響

圖1 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠尿糖（A）和血糖（B）濃度的影響Fig. 1 Effect of hydrolysate from Acaudina molpadioide on UG (A) and FBG (B) in diabetic mice

如圖1A、B所示，與C組小鼠相比，M組小鼠的空腹尿糖和血糖濃度均極顯著升高（P＜0.01），說明糖尿病小鼠造模成功。與M組相比，從第4周開始，APG1、APG2、Me組的空腹血糖含量均極顯著下降（P＜0.01）。APG1、APG2組的尿糖含量與Me組下降趨勢(shì)相同。

2.3 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠糖代謝的影響

圖2 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠糖代謝的影響Fig. 2 Effect of hydrolysate from Acaudina molpadioide on glucose metabolism in diabetic mice

如圖2所示，在糖代謝實(shí)驗(yàn)中，與C組小鼠相比，M組小鼠出現(xiàn)耐糖量異常，給予0.5 g/kg mb葡萄糖在0.5 h時(shí)血糖濃度明顯升高。與M組相比，APG1、APG2、Me組都明顯下降（P＜0.01）。且各組血糖濃度都于糖負(fù)荷0.5 h時(shí)達(dá)峰值。如表2所示，與C組相比，M組小鼠的GSP濃度和HbA1c水平均極顯著升高。與M組相比，APG1、

表2 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠GSP濃度和HbA1c水平的影響Table 2 Effect of hydrolysate from Acaudina molpadioide on GSP and HbA1c in diabetic mice

APG2、Me組的GSP濃度與HbA1c水平均極顯著下降。其中，APG1組的下降趨勢(shì)相比較其他組更明顯。

2.4 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠胰島素分泌的影響

表3 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠FINS、HOMA-IR、ISI水平的影響Table 3 Effect of hydrolysate from Acaudina molpadioide on FINS,HOMA-IR and ISI in diabetic mice

如表3所示，與C組相比，M組血清中FINS、HOMA-IR水平均極顯著上升，ISI極顯著下降。與M組相比，APG2組能夠極顯著提高FINS水平；APG1組能夠極顯著降低HOMA-IR水平。

2.5 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響

表4 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響Table 4 Effect of hydrolysate from Acaudina molpadioide on serum lipids in diabetic micemmol/L

如表4所示，與C組相比，M組小鼠的TC、TG、LDL-C濃度極顯著升高，HDL-C濃度極顯著下降。與M組相比，APG2組能極顯著降低TC、LDL-C水平。海地瓜酶解液對(duì)TG濃度無(wú)顯著影響。

2.6 差異基因的篩選

2.6.1 芯片的雜交

采用非監(jiān)督聚類的等階聚類方法（hierarchical clustering）對(duì)模型對(duì)照組小鼠腎臟和海地瓜給藥組小鼠腎臟細(xì)胞的RNA表達(dá)做比較分析后，選擇出差異倍數(shù)大于2的差異基因（表5）。

表5 APG2組和模型組部分差異表達(dá)基因Table 5 Selected differentially expressed genes

圖3 小鼠腎臟基因分布火山圖Fig. 3 Volcano plot for gene distribution in mouse kidney

利用基因分布的火山圖展示了食用海地瓜酶解液后的小鼠腎臟的基因表達(dá)差異性。上調(diào)差異基因?yàn)榫G色，下調(diào)差異基因?yàn)榧t色，黑色為相同基因（圖3）。

圖4 小鼠腎臟上調(diào)基因（A）和下調(diào)基因（B）的聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of up-regulated genes (A) and down-regulated genes (B) in mouse kidney

利用Clustral W進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。模型對(duì)照組小鼠的3 個(gè)組聚集在一起，APG2的小鼠分為3 個(gè)組聚集在一起，M組和APG2組存在顯著差異。食用海地瓜酶解液的小鼠腎臟共有55 684 個(gè)基因被篩選出，其中差異表達(dá)基因81 個(gè)，上調(diào)基因54 個(gè)，下調(diào)基因27 個(gè)。

2.6.2 差異基因的功能分析

圖5 上調(diào)基因（A）和下調(diào)基因（B）分布情況Fig. 5 Distribution of up-regulated genes (A) and down-regulated genes (B)

如圖5所示，從差異基因本體分析（gene ontology，GO）顯示小鼠腎臟差異表達(dá)基因81 條。生物過程在APG2組上調(diào)基因中與新陳代謝相關(guān)的基因占12.7%，與信號(hào)傳遞有關(guān)的基因占16.7%，與調(diào)控相關(guān)的基因占29%；下調(diào)基因中與新陳代謝相關(guān)的基因占13.7%，與信號(hào)傳遞相關(guān)的基因占7.7%，與調(diào)控相關(guān)的基因占16%。分子功能分析在APG2組上調(diào)基因中具有催化活性功能的基因占12%，具有離子運(yùn)輸功能的基因占14.8%，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、電子傳遞等功能的基因占22%。細(xì)胞組成元件中細(xì)胞器成分占6.7%，蛋白質(zhì)等生物大分子占33%，細(xì)胞外基質(zhì)占16.7%，剩余的小顆粒物質(zhì)占9.6%。

表6 差異基因的KEGG代謝通路分析Table 6 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

從KEGG差異代謝通路分析的結(jié)果（表6）顯示，差異基因一共參與了13 條代謝通路，主要涉及了與糖尿病形成相關(guān)的通路，與幾種氨基酸的生物合成相關(guān)的通路，以及相關(guān)大分子物質(zhì)分泌合成的一系列通路。

2.7 基因芯片及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖6 絲裂原活化蛋白激酶代謝通路關(guān)鍵基因在基因芯片（A）和qRT-PCR（B）中的表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of the key genes in MAPK signaling pathway detected by gene chip (A) and qRT-PCR (B)

如圖6所示，基因slc2A4、aqp5、aldH1a3、bcaT1、ubd、akr1B3、slc7A13、nupR1、hdc、在APG2組小鼠中的mRNA表達(dá)水平為上調(diào)，基因ntrK1、ptpN5在APG2組小鼠中的mRNA表達(dá)水平為下調(diào)，這與在基因芯片中的表達(dá)水平基本相同。

3 討 論

3.1 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠糖代謝的影響

糖尿病是一種慢性內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，目前臨床上用于治療糖尿病的藥物雖然效果較好，但副作用較大，不能長(zhǎng)期應(yīng)用[23-24]。而海參作為常見的食品，具有低脂肪、高蛋白的特點(diǎn)，對(duì)機(jī)體更加溫和、持久且無(wú)毒副作用。因此，海參治療糖尿病引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)海地瓜酶解液具有顯著的調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝的作用。有研究發(fā)現(xiàn)海參酶解液具有顯著降血糖功效[25]。2型糖尿病中的糖代謝紊亂常體現(xiàn)在FBG、葡萄糖（glucose，Glu）、GSP、HbA1c等水平都有不同程度升高的現(xiàn)象。糖代謝紊亂所導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)血糖升高，會(huì)產(chǎn)生IR，使機(jī)體代償性地增加胰島素分泌并降低胰島素的清除[26]。在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了海地瓜酶解液能夠顯著降低db/db糖尿病小鼠的FBG、Glu、GSP、HbA1c等水平，表明海地瓜酶解液對(duì)db/db糖尿病小鼠的糖代謝紊亂具有一定的緩解作用。

3.2 海地瓜酶解液對(duì)糖尿病小鼠脂代謝的影響

血脂主要是指血漿內(nèi)的膽固醇和甘油三酯，脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為TC和TG水平的升高，常伴有HDL-C水平的降低與LDL-C水平的升高[27]。2型糖尿病與脂代謝紊亂密不可分[28]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病脂代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制主要是由于脂蛋白酯酶活性降低，而脂蛋白酯酶的活性高低與胰島素的分泌有關(guān)[29-30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海地瓜酶解液能夠在不同程度上降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，表現(xiàn)出了其對(duì)脂代謝也有緩解的作用。

3.3 海地瓜酶解液對(duì)糖、脂代謝調(diào)節(jié)作用機(jī)制的探討

目前的研究主要認(rèn)為糖尿病與IR，以及由其引起的糖脂代謝紊亂有關(guān)[31]。在糖尿病發(fā)病過程中，胰島素分泌不足，會(huì)使體內(nèi)的糖代謝、脂代謝等多種代謝發(fā)生紊亂，嚴(yán)重影響了患者的身心健康[32]。而糖代謝與脂代謝之間有著非常密切的聯(lián)系，兩者相輔相成，相互作用。因此，糾正糖脂代謝紊亂是治療糖尿病的重要手段。

本實(shí)驗(yàn)建立的db/db糖尿病小鼠模型在出現(xiàn)糖代謝紊亂癥狀后，也出現(xiàn)了明顯的脂代謝紊亂與胰島素抵抗現(xiàn)象，說明了胰島素抵抗、糖代謝、脂代謝之間有著密不可分的聯(lián)系。同樣，脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致IR的持續(xù)存在。當(dāng)有糖代謝紊亂共同作用時(shí)，會(huì)加速這一過程的發(fā)生。糖脂代謝紊亂均導(dǎo)致了胰島β細(xì)胞一直處于高負(fù)荷工作狀態(tài)下，最終導(dǎo)致衰竭[33]。糖代謝紊亂可以引起脂代謝紊亂，因?yàn)樘侵x是協(xié)同的。因此，血糖水平不僅取決于糖代謝的調(diào)節(jié)，脂代謝水平也對(duì)其具有很大的影響。同時(shí)，脂代謝紊亂也可加重糖代謝紊亂。脂代謝紊亂會(huì)抑制胰島素和葡萄糖輸送到靶細(xì)胞，胰島素通過與其受體結(jié)合來轉(zhuǎn)運(yùn)和利用葡萄糖，血脂升高減少胰島素靶組織血流量，降低其對(duì)葡萄糖的攝取。由于IR，胰島素對(duì)葡萄糖輸出的抑制和刺激外周組織肌肉攝取葡萄糖存在缺陷，促使糖異生與葡萄糖的輸出。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給db/db糖尿病小鼠不同劑量的海地瓜酶解液，能夠有效地降低尿糖、FBG、Glu、GSP、HbA1c的水平，說明海地瓜酶解液能夠減緩糖尿病小鼠的糖代謝紊亂。同時(shí)，海地瓜酶解液也在不同程度上降低了TC、TG、LDL-C水平，升高了HDL-C的水平，表現(xiàn)出了其對(duì)脂代謝也有緩解的作用。而各組小鼠的胰島素含量在治療后呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，大大降低了IR，升高了ISI。了解到海地瓜酶解液對(duì)db/db小鼠的糖脂代謝紊亂有一定調(diào)節(jié)作用并能夠有效治療糖尿病之后，本實(shí)驗(yàn)通過基因芯片技術(shù)從基因水平上繼續(xù)探索海地瓜酶解液治療糖尿病小鼠的作用機(jī)制。

基因芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明喂食海地瓜酶解液的糖尿病小鼠與對(duì)照組小鼠基因表達(dá)出了明顯差異，APG2組相對(duì)于模型組上調(diào)的基因數(shù)量明顯多于下調(diào)基因的數(shù)量，差異基因主要包括信號(hào)傳遞因子、能量代謝、糖代謝、脂代謝等。此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，slc2A4基因調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporters，GLUT）-4有明顯的上調(diào)現(xiàn)象。GLUT-4是這些組織細(xì)胞的主要葡萄糖運(yùn)載體[34-35]。當(dāng)胰島素與受體相結(jié)合后，會(huì)發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的生理作用[35]。許多研究表明，GLUT-4的表達(dá)或活性下降將會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取和利用能力的減弱[36-37]。在db/db糖尿病小鼠中，增加GLUT-4的表達(dá)，改善外周組織對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，是防治糖尿病尤其是改善胰島素抵抗的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。從實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，調(diào)控GLUT-4的slc2A4基因在海地瓜酶解液作用的糖尿病小鼠與模型組對(duì)比中明顯上調(diào)，這與以往的報(bào)道相一致。這表明海地瓜酶解液能夠有效促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)葡萄糖的運(yùn)輸，使進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖減少，從而達(dá)到抑制胰島素抵抗的作用。

海地瓜酶解液對(duì)db/db糖尿病小鼠的調(diào)節(jié)作用是多種功能共同促進(jìn)的結(jié)果，不論是在降低血糖還是調(diào)節(jié)血脂上，均能改善小鼠在糖代謝與脂代謝紊亂的多種指標(biāo)。但由于酶解液的成分比較復(fù)雜，對(duì)糖類和脂類的代謝調(diào)節(jié)作用機(jī)制比較復(fù)雜，因此，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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