注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉凝膠負(fù)載富血小板血漿和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)牙周再生的研究*

鄧蔡 張麗 冷衛(wèi)東 歷丹 桂婷

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心牙周科,湖北 十堰 442000)

牙周組織的再生一直以來(lái)都是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，在再生過(guò)程中生長(zhǎng)因子發(fā)揮了巨大的作用[1,2]。但由于生長(zhǎng)因子易失活、易流失的特點(diǎn)，其應(yīng)用長(zhǎng)期以來(lái)都受到了限制。近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，不少理想的生物相容性的支架材料在臨床上得到了應(yīng)用[3-4]。注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉(chitosan/β-glycerol phosphate disodium salt，C/GP)是一種生理中性、在37℃時(shí)可形成凝膠的物質(zhì)，對(duì)大分子藥物具有緩釋性，能夠作為細(xì)胞的載體并維持細(xì)胞活性[5，6]。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)富含生長(zhǎng)因子，能夠從自體外周血中提取，故不存在免疫排斥反應(yīng)，在牙周組織再生中能夠發(fā)揮巨大作用[4]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞((bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種理想的種子細(xì)胞，具有取材容易、增殖性強(qiáng)、易于成活等多種優(yōu)勢(shì)[7，8]。本研究將分析可注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉凝膠負(fù)載富血小板血漿和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)牙周再生的效果。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 取3只健康雄性雜種犬，年齡1～2歲，體重15～20kg。 試劑：醫(yī)用級(jí)殼聚糖(青島博益特生物材料有限公司提供，脫乙酰度91%)，β-甘油磷酸二鈉、牛凝血酶、胰蛋白酶(上海研生生化試劑有限公司)，優(yōu)純級(jí)乙酸(國(guó)藥集團(tuán))，胎牛血清(西安熱默爾生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco)，人淋巴細(xì)胞分離液(深圳市偉通生物科技有限公司)。儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB公司)，倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1 C/GP溶液制備方法 于8ml 0.1mol/L的乙醇溶液中置入殼聚糖0.2g，使用攪拌器攪拌約2h。把0.56gβ-甘油磷酸鈉置于2ml雙蒸水中攪勻并振蕩5min。將上述兩種溶液進(jìn)行20min冰浴，而后把β-甘油磷酸鈉逐滴加入殼聚糖溶液并混勻攪拌10min。所得C/GP溶液的β-甘油磷酸鈉質(zhì)量濃度為5.6%，殼聚糖質(zhì)量濃度為2.0%。

1.2.2 PRP的制備 采集犬靜脈血10ml加入裝有1ml 10%枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，立刻采用二次離心法進(jìn)行PRP的制備，可獲得1ml PRP，置于-70℃冰箱中貯存。

1.2.3 BMSCs培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 采集犬髂后上棘骨髓進(jìn)行BMSCs的原代培養(yǎng)，并對(duì)第三代BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.2.4 根分叉缺損模型的制備 將每只犬的上、下頜的第二、第三前磨牙與第一磨牙共10顆牙作為本次研究的實(shí)驗(yàn)牙，對(duì)3只犬分別注射0.1ml陸眠寧進(jìn)行麻醉。依據(jù)既往文獻(xiàn)[9,10]方法進(jìn)行前磨牙區(qū)Ⅱ度根分叉缺損制備，制備完畢后通過(guò)垂直褥式法對(duì)牙齦瓣進(jìn)行縫合。依據(jù)隨機(jī)分組結(jié)果對(duì)各組模型進(jìn)行相應(yīng)處置：A組僅在缺損處注射C/GP；B組在缺損處注射C/GP+PRP(C/GP：PRP=1:2)；C組在缺損處注射C/GP+106/m BMSCs；D組在缺損處注射C/GP+PRP+106/m BMSCs；對(duì)照組在缺損處不注射任何物質(zhì)。術(shù)后連續(xù)3天對(duì)犬進(jìn)行青霉素靜注以防感染，1周內(nèi)食用流質(zhì)食物，此后轉(zhuǎn)為半流質(zhì)食物。

1.2.5 標(biāo)本處理與組織學(xué)觀察 術(shù)后8周將實(shí)驗(yàn)犬處死，采集樣本用40g/L甲醛固定3天，常規(guī)脫鈣處理，制作5μm厚切片，每個(gè)組織隨機(jī)選取10個(gè)切片進(jìn)行觀察測(cè)量。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)新生牙周組織部位的再生情況進(jìn)行觀察，并用微尺對(duì)新生牙骨質(zhì)、新生牙周膜組織、新生牙槽骨的新生情況進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，對(duì)各組牙周缺損再生情況進(jìn)行X線觀察。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)犬在術(shù)后均未發(fā)生異常癥狀，處死時(shí)均健康狀況良好。實(shí)驗(yàn)牙周邊未見(jiàn)牙石，牙齦部位愈合理想，深度約為1.2～1.7mm。

2.2 牙周缺損X線片觀察結(jié)果 觀察X線片可知，B、C、D組的牙周缺損部位均有明顯的牙槽再生現(xiàn)象，且骨密度均顯著高于A組與對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

2.3 組織學(xué)觀察與測(cè)量結(jié)果 B組、C組及D組觀察鏡下均可見(jiàn)新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維生長(zhǎng)，D組牙周組織再生最為明顯，新生的牙槽骨幾乎充滿根分叉區(qū)。而A組與對(duì)照組的新生牙組織則較少，根分叉區(qū)存在大量上皮組織(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，B、C、D組的新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維測(cè)量值均顯著高于A組和對(duì)照組(P<0.05)；D組各指標(biāo)值顯著高于B和C組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組和對(duì)照組僅有少量的牙周組織再生，兩組差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表1。

Table1Measurementsofalveolarbone,newcementumandperiodontalligamentfiberineachgroup

組別新生牙槽骨新生牙骨質(zhì)新生牙周膜纖維A組1.80±0.251.78±0.351.69±0.21B組4.22±0.29①4.16±0.30a①4.14±0.23①C組4.17±0.31①4.14±0.19①4.03±0.29①D組4.91±0.39①②4.79±0.26①②4.72±0.31①②對(duì)照組1.87±0.231.76±0.241.74±0.30

注：與A組、對(duì)照組相比，①P<0.05；與B組、C組相比，②P<0.05

3 討論

注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉(C/GP)作為新型的可注射性溫敏凝膠，生物相容性良好，目前已經(jīng)被作為種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子載體在組織工程中被廣泛利用。有研究曾將C/GP作為支架材料，并負(fù)載髓核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示髓核細(xì)胞能夠正常增殖，且其中Ⅱ型膠原表達(dá)較高[11，12]。PRP是一種包含有多種生長(zhǎng)因子的全血提取物，具有制備簡(jiǎn)易、自體無(wú)毒等特點(diǎn)，是理想的生長(zhǎng)因子來(lái)源。BMSCs則是一種未分化的原始祖細(xì)胞，有研究證明BMSCs能夠有效修復(fù)根分叉缺損，在牙骨質(zhì)、牙槽骨等組織的修復(fù)中起到重要作用[13，14]。

圖1各組術(shù)后8周牙周缺損X線片圖
Figure1X-rayfilmofperiodontaldefectat8weeksafteroperation

圖2 術(shù)后8周各組牙周缺損處牙周組織再生情況Figure 2 Periodontal tissue regeneration in periodontal defect at 8 weeks after operation注：A.對(duì)照組；B.C/GP；C.C/GP+PRP；D.C/GP+BMSCs ；E、F.C/GP+PRP+BMSCs

由于牙周炎造成的牙周組織缺損往往極不規(guī)則，選擇合適的支架材料與生長(zhǎng)因子使缺損區(qū)得到充分的修復(fù)是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題[15，16]。本研究中所使用的C/GP在常溫下為溶液，可以向缺損區(qū)進(jìn)行注射使之充滿缺損部位，并通過(guò)原位凝固維持空間和釋放生長(zhǎng)因子。結(jié)果顯示，A組與對(duì)照組牙槽雖出現(xiàn)了再生現(xiàn)象，但新生牙組織則較少，并且根分叉區(qū)存在大量上皮組織。這表明了C/GP能夠較好的與組織相容，且不會(huì)造成根分叉缺損部位的不良反應(yīng)，但同時(shí)C/GP也不會(huì)對(duì)牙周組織的再生起到促進(jìn)作用。既往文獻(xiàn)報(bào)道中，往往只研究了單一生長(zhǎng)因子在牙周組織再生中發(fā)揮的作用，但單一生長(zhǎng)因子由于不具有多生長(zhǎng)因子聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，因此效果并不理想[17，18]。本研究分析了C/GP+PRP+BMSCs 對(duì)牙周組織再生中的應(yīng)用效果，結(jié)果顯示B組、C組及D組均有新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維生長(zhǎng)，D組牙周組織再生最為明顯，且各指標(biāo)測(cè)量值均顯著高于A組、對(duì)照組(P<0.05)，D組各指標(biāo)值顯著高于B、C組(P<0.05)。這表明PRP的使用能夠有效提高牙周組織的再生與愈合，PRP與C/GP由于在液態(tài)時(shí)復(fù)合，因此復(fù)合更為均勻，保證了材料內(nèi)的PRP不會(huì)輕易經(jīng)血液沖刷等流失，能夠在缺損部位釋放高濃度的生長(zhǎng)因子。D組的牙周組織再生最為顯著，這可能是由于C/GP在原位凝固后為BMSCs創(chuàng)造了一個(gè)立體增殖空間，再加之PRP中高濃度生長(zhǎng)因子的釋放，BMSCs在牙周組織中的分化與增殖更為迅速。有研究表明，1%的PRP即可使BMSCs增殖速度加快，二者聯(lián)用能夠發(fā)揮良好的骨修復(fù)效果[19，20]。

4 結(jié)論

本文資料顯示，C/GP負(fù)載PRP和BMSCs有助于促進(jìn)牙周組織的再生，值得在臨床進(jìn)一步深入研究與利用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]于新波. 牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞膜片牙周再生能力的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 山東大學(xué), 2014.

[2]巴格那. 可注射性納米殼聚糖骨形成蛋白-2復(fù)合體用于大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的效果研究[D]. 蘭州大學(xué), 2015.

[3]Yu B, Zhang Y, Li X,etal. The use of injectable Chitosan/Nanohydroxyapatite/collagen composites with bone marrow mesenchymal stem cells to promote ectopic bone formation in vivo[J]. Journal of Nanomaterials, 2013, 2013(3):3805-3816.

[4]趙月亮. 自體富血小板纖維蛋白牙周再生治療的護(hù)理配合[J]. 天津護(hù)理, 2015, 23(5):429-430.

[5]朱斌, 趙喜聰, 李楠,等. 組織特異性間充質(zhì)干細(xì)胞的牙周再生對(duì)比[J]. 口腔生物醫(yī)學(xué), 2015, 6(3):150-154.

[6]Khojasteh A, Behnia H, Hosseini F S,etal. The effect of PCL-TCP scaffold loaded with mesenchymal stem cells on vertical bone augmentation in dog mandible: A preliminary report [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B Applied Biomaterials, 2013, 101(5):848-854.

[7]徐景. 早期拔牙窩愈合組織對(duì)牙周組織再生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D]. 山東大學(xué), 2015.

[8]馬君義, 陳香玲, 盛愛(ài)霞,等. 載高烏甲素可注射殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏水凝膠的制備與性能研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2015, 50(19):1696-1703.

[9]Oliveira J M, Sousa R A, Kotobuki N,etal. The osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells cultured with dexamethasone-loaded carboxymethylchitosan/poly(amidoamine) dendrimer nanoparticles.[J]. Biomaterials, 2009, 30(5):804-813.

[10] 王阿嫻, 唐麗, 梁源,等. 人骨髓來(lái)源細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2014, 18(6):938-943.

[11] 王敬, 徐燕, 楊洋,等. 生長(zhǎng)因子在牙周炎位點(diǎn)保存中促進(jìn)骨組織再生的觀察[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(9):1329-1333.

[12] Kusumastuti Y, Shibasaki Y, Hirohara S,etal. Encapsulation of rat bone marrow stromal cells using a poly-ion complex gel of chitosan and succinylated poly(Pro-Hyp-Gly)[J]. Journal of Tissue Engineering & Regenerative Medicine, 2015, 215(11):249-262.

[13] 高瑩. 自體濃縮生長(zhǎng)因子(CGF)在犬牙周組織缺損再生中的研究[D]. 山東大學(xué), 2015.

[14] 李樹(shù)臣, 尚緒山, 李東,等. PRP聯(lián)合鹽酸川芎嗪對(duì)BMSCs體外增殖及向成骨細(xì)胞分化的影響[J]. 生物骨科材料與臨床研究, 2015, 12(5):1-4.

[15] Wang N, Yang Z, Zang M,etal. Carbon nanotubes functionalized with fibroblast growth factor accelerate proliferation of bone marrow-derived stromal cells and bone formation[J]. Nanotechnology, 2013, 24(43):435101-435101.

[16] Gnecchi M, Melo L G. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium[J]. Methods in Molecular Biology, 2009, 482(2):281.

[17] 許春姣, 郭峰, 高清平,等. 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與黃芪-殼聚糖/聚乳酸支架對(duì)犬牙周骨缺損再生的影響[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006, 31(4):512-517.

[18] 陳玉陽(yáng). 可注射納米殼聚糖/骨形成蛋白復(fù)合物修復(fù)大鼠頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 蘭州大學(xué), 2014.

[19] 趙清桐, 賴仁發(fā), 汪距,等. 殼聚糖/β-磷酸三鈣/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2可注射性復(fù)合體修復(fù)兔下頜骨缺損[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2009, 13(51):10065-10068.

[20] 謝富強(qiáng), 魚(yú)靈會(huì), 王新,等. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白氰基丙烯酸復(fù)合修復(fù)大鼠下頜骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[C]// 全國(guó)口腔頜面外科修復(fù)重建學(xué)術(shù)會(huì)議暨國(guó)際研討會(huì). 2013.