推拿聯(lián)合跑輪訓(xùn)練對大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的效果①

馬穎，嚴雋陶，馬書杰，陸永嘉，王春紅，史智君，陶然，孔亞敏

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院推拿科，上海市200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市201203

骨骼肌損傷在生活、運動中常見[1]。神經(jīng)損傷后，患者進入慢性肌肉廢用性肌病的惡性循環(huán)，引起肌肉萎縮、無力和疼痛等臨床表現(xiàn)[2]。骨骼肌失神經(jīng)支配后，如果不能及時獲得神經(jīng)再支配，骨骼肌將發(fā)生不可逆性萎縮，甚至導(dǎo)致功能喪失[3]。傳統(tǒng)推拿手法常與主動運動配合，作為周圍神經(jīng)損傷的康復(fù)方法。本研究觀察推拿手法聯(lián)合跑輪訓(xùn)練對大鼠坐骨神經(jīng)橫斷傷模型失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1月齡Sprague-Dawley大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，雄性，由上海斯萊克實驗動物公司提供，許可證號SCXK(滬)2012-0002。實驗前1周于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)，許可證號SYXK(滬)2014-0008。自由飲食，室溫18℃，濕度(45±5)%。

采用計算機隨機分組，將大鼠分為對照組(n=40)和手法組(n=40)，每組大鼠按取材時間不同，再分為4個小組，每小組10只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛：上海西唐生物科技有限公司。石蠟、甲醛、氨水、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2：上海國藥集團。DAB濃縮試劑盒、廣譜二抗：上海長島生物技術(shù)有限公司。胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)、抗PCNA工作液：ABCAM公司。ABC試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。蘇木素、中性樹脂：北京索寶萊科技有限公司。CX41正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。IMS圖像分析系統(tǒng)：基爾頓生物有限公司。電子天平：江蘇衡器廠。YLS-15A大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機：成都儀器廠。自制手法模擬儀：本校與上海復(fù)旦大學(xué)共同研制。

1.3 模型制備

采用坐骨神經(jīng)橫斷傷模型。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮，常規(guī)消毒，無菌條件下臀部切口，于坐骨結(jié)節(jié)下方0.5 cm處顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)干并鈍性分離，距梨狀肌下緣1 cm處切斷坐骨神經(jīng)干，兩斷端返折180°后分別縫入附近肌組織?？p合肌間筋膜與皮膚。術(shù)后碘伏消毒切口，傷口灑入適量注射用青霉素鈉粉針，縫合傷口。

1.4 干預(yù)方法

手法組于術(shù)后21 d開始治療。采用自制推拿手法模擬儀模擬捏法治療，壓力6 kPa，捏2 min暫停1 min，120次/min，共5 min。采用YLS-15A大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機進行主動運動訓(xùn)練，0.65 m/轉(zhuǎn)，5 r/min，共5 min。每天1次。

對照組不做干預(yù)。

1.5 取材及檢測

各組分別在干預(yù)后1、2、3、4個月各取10只大鼠進行檢測。

1.5.1 腓腸肌濕重比

大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，剝離并完整取下雙側(cè)腓腸肌，迅速放于電子天平上稱量，記錄右側(cè)/左側(cè)質(zhì)量比。

1.5.2 肌衛(wèi)星細胞計數(shù)

腓腸肌組織修切成小塊，10%福爾馬林液中固定24 h。梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，厚6 μm。切片脫蠟、漂洗、脫水、透明、封片。PCNA染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察不相交但相鄰的10個視野，計數(shù)PCNA陽性細胞數(shù)。

1.5.3 免疫組化染色

腓腸肌組織福爾馬林液中固定48 h，洗滌、脫水、浸蠟包埋。切片，厚6 μm。切片脫蠟、脫水，抗原修復(fù)。玻片置3%H2O2中，濕盒孵育10 min，0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；滴加IGF-Ⅰ一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；滴加二抗并孵育20～30 min，0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；蘇木素染色，透明并封片。400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察不相交但相鄰的10個視野，計數(shù)IGF-Ⅰ陽性細胞數(shù)。

1.5.4 HE染色

如免疫組化流程制做切片，烤片、脫蠟、水化，蘇木精染色、伊紅染色，透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕重比

腓腸肌濕重比總體呈下降趨勢，干預(yù)3個月，對照組肌濕重比高于手法組(P＜0.05)；干預(yù)4個月，手法組肌濕重比有高于對照組的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組干預(yù)不同時間點腓腸肌濕重比比較

2.2 肌衛(wèi)星細胞數(shù)

兩組腓腸肌衛(wèi)星細胞數(shù)干預(yù)后2個月開始持續(xù)升高，手法組在干預(yù)后3個月，肌衛(wèi)星細胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.01)。見表2。

表2 兩組干預(yù)不同時間點肌衛(wèi)星細胞數(shù)比較

2.3 IGF-Ⅰ表達

兩組干預(yù)后，腓腸肌IGF-Ⅰ表達呈上升趨勢，從干預(yù)2個月開始，手法組IGF-Ⅰ陽性細胞數(shù)高于對照組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組干預(yù)不同時間點IGF-Ⅰ陽性細胞數(shù)比較

2.4 HE染色

干預(yù)1個月時，兩組大部分肌纖維斷裂，橫紋模糊或消失，肌細胞扭曲。2個月時，對照組間質(zhì)中成纖維細胞增生，脂肪變性；手法組肌纖維排列尚可，出現(xiàn)大量肌衛(wèi)星細胞，間隙較1個月時有好轉(zhuǎn)，仍有肌纖維斷裂。3個月時，對照組肌纖維排列致密紊亂，部分肌纖維斷裂；手法組細胞核增多、聚集，部分肌纖維退變和斷裂，部分區(qū)域間質(zhì)疏松。4個月時，對照組細胞核增多、聚集，間質(zhì)中成纖維細胞增生；手法組部分肌纖維斷裂，肌纖維排列較為整齊，間隙較3個月時變窄。見圖1。

3 討論

骨骼肌萎縮引起肌力和耐力喪失，肢體活動受限，損害生活質(zhì)量，加劇跌倒和骨折風(fēng)險，引發(fā)進一步肌肉萎縮。后期，肌肉萎縮導(dǎo)致虛弱和獨立生活喪失，給患者家庭和整個社會造成巨大負擔(dān)[4]。失神經(jīng)骨骼肌萎縮的防治關(guān)鍵是促進神經(jīng)再生[5]。指導(dǎo)患者進行正確、適當(dāng)?shù)倪\動訓(xùn)練，是促進受損神經(jīng)再生、恢復(fù)肢體功能的有效方法[6]。

推拿能促進肌衛(wèi)星細胞增殖，調(diào)節(jié)相關(guān)生肌因子的表達[7-9]，促進快肌纖維恢復(fù)，使失神經(jīng)后骨骼肌結(jié)構(gòu)形態(tài)改善，延緩骨骼肌萎縮[10]。推拿可促進大鼠周圍神經(jīng)損傷后行為學(xué)、形態(tài)學(xué)恢復(fù)[11]，通過促進內(nèi)源性因子及相關(guān)蛋白表達，促進神經(jīng)再生及功能恢復(fù)[12-13]。

周圍神經(jīng)損傷后，康復(fù)訓(xùn)練對靶器官功能恢復(fù)十分重要。耐力運動如跑臺訓(xùn)練，可調(diào)節(jié)損傷后細胞和分子反應(yīng)，增加再生神經(jīng)元和軸突生長的速率和程度，促進周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再支配[14]。失神經(jīng)支配期間，跑臺訓(xùn)練能促進血液循環(huán)，直接改善肌肉營養(yǎng)，促進肌肉恢復(fù)，增加等長肌力[15-16]。

骨骼肌是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的靶器官。失神經(jīng)支配導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降，肌肉纖維變形[17]。當(dāng)損傷涉及下運動神經(jīng)元時，萎縮特別嚴重，肌肉組織會經(jīng)歷纖維化和脂肪替代，從而產(chǎn)生失神經(jīng)的退化肌肉[18]。

本研究顯示，骨骼肌失神經(jīng)支配后，肌肉出現(xiàn)明顯萎縮，肌濕重比最多可減少60%左右。治療組干預(yù)3、4個月時，肌濕重比有所回升，趨于平穩(wěn)；對照組3個月時肌濕重比上升較多，但4個月時又有所下降。多數(shù)時期，兩組肌濕重比無顯著性差異，說明手法聯(lián)合跑輪訓(xùn)練不能從根本上阻止失神經(jīng)骨骼肌萎縮的趨勢。

圖1 兩組腓腸肌HE染色

骨骼肌含有少量單核的干細胞，稱為肌衛(wèi)星細胞，占肌細胞核總數(shù)2%～10%[19]。肌衛(wèi)星細胞有強大的再生能力，正常情況下處于靜息狀態(tài)；肌肉損傷后，肌衛(wèi)星細胞被激活增殖，并表達肌原性調(diào)節(jié)因子，產(chǎn)生肌源性祖細胞。肌源性祖細胞能與原有肌纖維融合，也可互相融合，使肌肉再生[20-21]。即使多次創(chuàng)傷后，肌衛(wèi)星細胞數(shù)也保持不變[22]。肌衛(wèi)星細胞適當(dāng)?shù)仄胶忪o止、自我更新和復(fù)制能力，對于骨骼肌再生至關(guān)重要。以往研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌失神經(jīng)支配4個月后，肌衛(wèi)星細胞數(shù)量極少，導(dǎo)致肌肉萎縮不可逆；失神經(jīng)2～3個月時再神經(jīng)化，肌衛(wèi)星細胞增殖，促使肌功能恢復(fù)[23]。

本研究顯示，干預(yù)3個月時，肌衛(wèi)星細胞快速增殖，高于對照組；4個月時兩組數(shù)目趨于相等。與既往研究一致，說明手法聯(lián)合跑輪訓(xùn)練能夠促進肌衛(wèi)星細胞增殖，進而促進失神經(jīng)骨骼肌再生，延緩肌萎縮。

肌衛(wèi)星細胞的激活與成肌分化受生長因子、激素、成肌調(diào)控因子等多種因素影響。IGF-Ⅰ是肌衛(wèi)星細胞增殖和骨骼肌干細胞終末分化的重要調(diào)節(jié)因子[7]。IGF-Ⅰ作為肌肉生長正向調(diào)節(jié)信號，是刺激肌衛(wèi)星細胞增殖、重塑肌肉的重要細胞因子[24]。它促進機體生長發(fā)育、參與組織修復(fù)，對促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成有顯著作用[25]。

本研究顯示，干預(yù)2～4個月時，兩組IGF-Ⅰ表達均增長，手法組高于對照組。我們推測，手法聯(lián)合跑輪訓(xùn)練能夠促進IGF-Ⅰ的表達，進而使肌衛(wèi)星細胞增殖，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮。

綜上所述，推拿手法聯(lián)合跑輪訓(xùn)練對大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮有一定作用，可能通過促進相關(guān)生長因子的表達，促進肌衛(wèi)星細胞增殖與分化實現(xiàn)。但骨骼肌再生是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，推拿延緩骨骼肌萎縮的機制和途徑還需要進一步深入研究。

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