人偏肺病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王超 鄭麗舒

100052北京,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARI)是一種導(dǎo)致全球人群發(fā)病和死亡的主要病因,2001年首次鑒定出的人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)已被證實(shí)在各年齡段都能引起ARI,且?guī)缀跛?歲以下的兒童都感染過(guò)hMPV[1]。人血清中hMPV抗體檢測(cè)結(jié)果表明,該病毒至少?gòu)?0世紀(jì)50年代起就一直在人群中傳播[2]。雖然hMPV感染所致癥狀一般表現(xiàn)溫和,但在特殊人群中也能引發(fā)致死性并發(fā)癥,因此建立及時(shí)準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法很重要。

1 hMPV分子特點(diǎn)及致病性

hMPV屬于單分子負(fù)鏈RNA病毒目,副粘病毒科,肺病毒亞科,肺病毒屬?；蚪M長(zhǎng)約13.3kb[3],可分為A、B兩型,根據(jù)G基因和F基因序列的不同,進(jìn)一步將其分為A1、A2、B1和B2四個(gè)亞型[4],其中A2還可分為A2a和A2b基因簇[5]。hMPV基因組為單負(fù)鏈RNA,包含8個(gè)蛋白編碼基因,編碼9個(gè)蛋白,從3′端到5′端依次為N-P-M-F-M2-SH-GL,分別為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子(M2-1)、RNA合成調(diào)節(jié)因子(M2-2)、小疏水糖蛋白(SH)、粘附蛋白(G)和病毒聚合酶(L)。 病毒RNA 與P、N、L、M2-1、M2-2蛋白共同形成直徑為17 nm的核衣殼,表面有由M蛋白和脂質(zhì)形成的包膜,包膜上含有由F、G和SH組成的刺突。在F蛋白和G蛋白的參與下,hMPV與細(xì)胞表面硫酸肝素受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。

hMPV感染在免疫功能正常的個(gè)體中癥狀表現(xiàn)很溫和,但對(duì)于早產(chǎn)兒、兒童、老年人和免疫受損患者,hMPV可以導(dǎo)致顯著的發(fā)病率和死亡率。據(jù)報(bào)道,32.7%hMPV感染患兒為有早產(chǎn)史的學(xué)齡前兒童,這些患兒患哮喘的機(jī)率更高[6]。hMPV感染還可導(dǎo)致足月孕婦的急性呼吸窘迫綜合征[7],引發(fā)嬰兒呼吸道感染合并難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)和重癥腦炎[8]。在惡性血液病患者中hMPV感染導(dǎo)致的重癥肺炎可合并多器官功能衰竭[9]。此外,hMPV還能在肺移植患者中引發(fā)嚴(yán)重感染[10]。一般來(lái)說(shuō),hMPV感染在ARI患者中所占的比例為4% ～16%[11],但不同地域和不同年份感染率會(huì)有所變化[12]。hMPV感染患者在臨床癥狀上與呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)感染十分相似[13],一般僅表現(xiàn)為輕度上呼吸道感染,嚴(yán)重者出現(xiàn)危及生命的細(xì)支氣管炎和肺炎,很難從臨床角度判斷感染病毒種類(lèi),因此建立合適特異的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法極為必要。

2 hMPV檢測(cè)方法的研究

2.1 分離培養(yǎng)hMPV在很多傳代細(xì)胞系中都能分離培養(yǎng),如 Vero、HEp-2、Hep G2、293 和 LLC-MK2等[14-15],培養(yǎng)過(guò)程中需外源加入 TPCK胰酶對(duì)hMPV的 F蛋白進(jìn)行切割以獲得感染性[2,16]。hMPV復(fù)制動(dòng)力學(xué)很慢,出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)間晚,在不同細(xì)胞系中CPE的表現(xiàn)不同,有時(shí)還需盲傳培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),所以目前臨床診斷很少用到細(xì)胞培養(yǎng)。但作為檢測(cè)病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)[17],細(xì)胞培養(yǎng)具有簡(jiǎn)便、低成本和不需要復(fù)雜器械等優(yōu)點(diǎn),適合普通實(shí)驗(yàn)室操作。細(xì)胞培養(yǎng)能直觀反映病毒與細(xì)胞間的相互作用,是病毒學(xué)和臨床研究的基礎(chǔ),尋找合適有效的病毒分離培養(yǎng)方法具有十分重要的研究意義。

Reina等[18]通過(guò)Shell Vial Cultures技術(shù)對(duì)臨床hMPV感染的呼吸道樣本進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果表明這能成為一種快速、可靠的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方法。Isaeva等[19]用19種人和動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)hMPV,發(fā)現(xiàn)hMPV對(duì)人類(lèi)細(xì)胞中的clone 1-5C4株和貓腎細(xì)胞CRFK最敏感。Sato等[20]使用人惡性黑色素瘤細(xì)胞MNT-1培養(yǎng)hMPV,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于LLC-MK2和Vero E6,MNT-1能更早出現(xiàn)合胞體病變。此外,hMPV能在人正常呼吸道上皮細(xì)胞(BEAS-2B、16HBE140)中良好復(fù)制產(chǎn)生包涵體,且不需要外源加入TPCK胰酶[3,14],但也有研究表明hMPV在原代和傳代細(xì)胞系中感染率沒(méi)有差別[21]。利用Transwell培養(yǎng)板建立起的3D立體培養(yǎng)原代人呼吸道組織細(xì)胞(HAE)模型也可用于hMPV的感染研究[22],該模型能以更接近人體真實(shí)的環(huán)境揭示hMPV的感染機(jī)制和進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)。

2.2 核酸檢測(cè)

2.2.1 PCR方法：由于hMPV在細(xì)胞中生長(zhǎng)緩慢,臨床檢測(cè)主要采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法。hMPV N基因在核酸序列和氨基酸序列都是最保守的(分別為91.2%和98.4%),常用于hMPV檢測(cè),G基因是差異最大的(分別為79%和59.2%)[23],可用于分型,通過(guò)real time RT-PCR擴(kuò)增hMPV這兩個(gè)基因,進(jìn)行測(cè)序就可以鑒別診斷出hMPV的四種亞型[24]。另有研究顯示僅檢測(cè)N基因也能鑒定出aMPV和hMPV所有亞型[25]。此外,還可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)法擴(kuò)增hMPV M基因來(lái)鑒別hMPV的A、B型,該法具有較高的特異性和靈敏度,且不需要復(fù)雜的儀器,適用于實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[26]。由于呼吸道感染多為混合感染,逐個(gè)排查費(fèi)時(shí)費(fèi)力,利用FRET雜交探針和 SYBR Green染料[27-28]建立多重實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PCR方法能一次檢測(cè)多種DNA和RNA病毒,具有降低本低,簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)。BioFire公司通過(guò)微流控技術(shù)發(fā)明的FilmArray Respiratory Panel(FilmArray RP)是一種集樣品制備、擴(kuò)增、檢測(cè)和分析功能于一體的多重PCR系統(tǒng),可用于檢測(cè)急性呼吸道感染中常見(jiàn)病毒、細(xì)菌或真菌,具有簡(jiǎn)單、高效、快速的特點(diǎn)[29]。

2.2.2 核酸測(cè)序：RNA病毒由于基因組容易變異,除選擇高度保守的區(qū)域進(jìn)行PCR檢測(cè)之外,常需要結(jié)合測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)序技術(shù)能夠準(zhǔn)確提供hMPV流行株的變異情況,為研究hMPV致病機(jī)制提供依據(jù)。西班牙巴塞羅那兒童hMPV感染曾出現(xiàn)一種180 bp重復(fù)片段突變株,這種突變株很快成為了當(dāng)季流行株[30]。日本橫濱地區(qū)臨床hMPV樣本G基因測(cè)序分析時(shí),也發(fā)現(xiàn)有46.9% 的 A2b基因簇hMPV G基因產(chǎn)生了180 bp重復(fù)片段突變,該突變導(dǎo)致G蛋白產(chǎn)生了60個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列,是O鏈糖的潛在受體,可能導(dǎo)致hMPV對(duì)宿主免疫逃逸[31]。此外,近年興起的二代測(cè)序和三代測(cè)序技術(shù)能夠及時(shí)提供更為準(zhǔn)確有效的測(cè)序信息。

2.2.3 xMAP和xTAG技術(shù)：xMAP和xTAG技術(shù)是Luminex公司自創(chuàng)的熒光微球編碼技術(shù)和標(biāo)簽技術(shù),是臨床應(yīng)用型生物芯片主要采用的技術(shù)之一,已廣泛用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。Luminex在此基礎(chǔ)上發(fā)明的xTAGRespiratory Viral Panel(RVP呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒)可同時(shí)檢測(cè)19種呼吸道病毒及亞型,而相對(duì)于 xTAG RVP,Luminex 2015年推出NxTag respiratory pathogen panel(NxTAG RPP)還能同時(shí)檢測(cè)肺炎支原體和肺炎衣原體,對(duì)于某些病毒有更好的靈敏度[32]。與多重RT-PCR技術(shù)相比,NxTag技術(shù)也有高特異性、高靈敏度,操作更方便快捷等優(yōu)點(diǎn)。研究者也可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求靈活應(yīng)用xMAP和xTAG技術(shù),Yan等[33]在xMAP技術(shù)上融合多重RT-PCR技術(shù)建立了高通量多路液相芯片(rMLA),可同時(shí)檢測(cè)6種常見(jiàn)呼吸道病毒。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)與抗原檢測(cè)

2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：hMPV編碼三種表面蛋白,F、G和SH蛋白,其中F蛋白可以誘導(dǎo)有效的中和抗體,而G蛋白和SH蛋白的免疫原性很弱。采用單一重組抗原的ELISA只能檢測(cè)血清中一種hMPV抗體,不能準(zhǔn)確反映病毒感染情況,而Okamoto等[34]利用hMPV全部抗原建立的ELISA方法可以檢測(cè)患者血清中所有hMPV抗體,適用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢查和大規(guī)模篩查。此外,將金屬增強(qiáng)熒光法(MEF)與ELISA方法結(jié)合,通過(guò)高通量金屬增強(qiáng)熒光生物傳感器(HT-MEFB)檢測(cè)hMPV抗體,能顯著提高ELISA檢測(cè)的靈敏度[35]。

2.3.2 免疫熒光標(biāo)記法：免疫熒光標(biāo)記法分為直接免疫熒光法(DIF)和間接免疫熒光法(IFA),其中DIF因能在短時(shí)間特異地檢測(cè)病原體,是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)hMPV的常用方法。但也有研究表明雖然DIF有很高的特異性(99%),但檢測(cè)靈敏度卻很低(38%),不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[36]。相對(duì)于DIF,IFA在靈敏度和特異性上均高一些,hMPV小鼠單克隆抗體(mAb)能夠特異識(shí)別hMPV的N蛋白,靈敏度達(dá)到100%[37]。免疫熒光標(biāo)記法的局限性在于其檢測(cè)設(shè)備較貴且結(jié)果需要人為解讀,陽(yáng)性判斷的主觀性較強(qiáng)。

2.4 其他檢測(cè)方法質(zhì)譜(MS)技術(shù)具有快速、靈敏、特異、高通量、低成本的特點(diǎn),廣泛用于細(xì)菌的檢測(cè),但在病毒檢測(cè)的應(yīng)用還很少。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)可用于檢測(cè)臨床樣本和分離培養(yǎng)樣本中的hMPV蛋白質(zhì)組[38]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)也可用于檢測(cè)呼吸道病毒,相對(duì)于LC-MS/MS,MALDI-TOF MS能更迅速的鑒定病毒的型別,但LC-MS/MS具有更高的靈敏度,能夠鑒定出樣本中不同病毒[39]。質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)呼吸道病毒對(duì)臨床樣本的要求較高,需要進(jìn)行前期處理并優(yōu)化處理?xiàng)l件。

3 小結(jié)

hMPV是一種重要的呼吸道病毒,患者對(duì)于hMPV感染難以產(chǎn)生持久的免疫,常產(chǎn)生復(fù)發(fā)感染,截至目前,hMPV感染仍是常規(guī)的抗病毒治療和對(duì)癥治療,沒(méi)有疫苗。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)hMPV主要采用PCR和DIF,但完善傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法及新建立的質(zhì)譜方法能為hMPV檢測(cè)提供更全面的信息,根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求采用不同的檢測(cè)方法更有助于研究hMPV的分子流行病學(xué)、抗病毒藥物和疫苗研發(fā),以加強(qiáng)未來(lái)對(duì)hMPV的預(yù)防和控制能力。

利益沖突無(wú)