2009—2011年南京地區(qū)兒童急性呼吸道感染人冠狀病毒HKU1和NL63臨床與流行病學特征

閆坤龍 謝志萍 高寒春 高小倩 金玉 段招軍

210008,南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院消化科(金玉、閆坤龍)；100052北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(謝志萍、高寒春、段招軍)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒發(fā)病和死亡的主要原因,是導致5歲以下嬰幼兒死亡的首要病因[1],在兒童的急性呼吸道感染病原中90%以上是由病毒性病原引起,冠狀病毒是主要致病原之一[2]。人冠狀病毒分型包括20世紀60年代發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒OC43和229E；21世紀初發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒HKU1和NL63,以及具有強烈傳染性的冠狀病毒SARS和MERS[3]。冠狀病毒HKU1和NL63作為近些年發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒在南京地區(qū)的臨床和流行病學資料較少,特別是關(guān)于兒童急性呼吸道感染疾病的研究,因此,本研究于2009年8月份至2011年7月份對南京地區(qū)兒童冠狀病毒HKU1和NL63的感染情況進行了研究,對比分析了本地區(qū)兩種病毒在兒童中的臨床和分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 研究對象與標本采集

1.1.1 研究對象：2009年8月份至2011年7月份,收集因急性呼吸道感染于南京醫(yī)科大學兒童醫(yī)院就診和住院的患兒呼吸道分泌物標本1 286份,其中鼻咽抽吸物標本795份,咽拭子標本491份。

1.1.2 標本采集：對于鼻咽抽吸物標本采集：使用一次性無菌吸痰管對納入研究的患兒在就診當天經(jīng)單側(cè)鼻腔插入,深度7～8 cm,負壓吸取咽部分泌物1～2 ml,置于無菌采集管內(nèi),在超凈工作臺內(nèi)加入2 ml病毒保存液(含青霉素、鏈霉素和兩性霉素B濃度均為200 U/ml,0.125%BSA),旋渦振蕩器上震蕩混勻,置于-80℃低溫冰箱保存至檢測。對于咽拭子標本采集：以無菌棉拭子吸附無菌生理鹽水,采集兩側(cè)腭弓、咽部或扁桃體黏膜上的分泌物,放入含2 ml病毒保存液的滅菌凍存管中,置于-80℃低溫冰箱保存至檢測。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,征得患兒監(jiān)護人知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本處理和病毒RNA提?。簩⒉杉臉颖臼覝厝芙?置旋渦振蕩器上充分振蕩混勻,1 500×g離心10 min,吸取上清,使用QIAmp病毒RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取病毒RNA,操作步驟嚴格參照說明書。

1.2.2 HCoV-HKU1和HCoV-NL63核酸檢測：提取的RNA以隨機引物,采用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript?Ⅱ(美國Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行病毒檢測。具體操作方法參考文獻[4-5],每次反應均設(shè)立陽性、陰性對照。擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,陽性產(chǎn)物進行核苷酸序列測定,弱陽性標本經(jīng)QIAquick DNA凝膠純化回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化回收后,使用T4連接酶連接到pGEM-T載體(美國 Promega公司)置于4℃環(huán)境中過夜,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a,將篩選為陽性克隆的菌落挑取后培養(yǎng)的菌液進行核苷酸序列測定。

1.3 序列測定及分析測序反應由商業(yè)測序公司完成。使用DNAman軟件編輯測序序列,序列分析采用美國生物醫(yī)學信息中心(NCBI)的在線工具Blast,并采用MEGA7.0軟件繪制基因的系統(tǒng)進化樹。比較和進化分析所采用的基因序列GenBank序列號如下：HCoV-HKU1(NC-006577,DQ415914,DQ415911,DQ415912)；HCoV-NL63(AY567487,KF530113,KF530110)；HCoV-OC43(KX344031,KF530098)； HCoV-229E(NC-002645)；PEDV(NC-003436)；TGEV(NC-002306)；FIPV(NC-002306)；MHV(AF201929)；BCoV(NC-003045)；HCoV-SARS(AY274119)；HCoV-MERS(KT225476)。

1.4 混合感染分析經(jīng)檢測為HCoV-HKU1或HCoV-NL63陽性標本,采用PCR或RT-PCR方法,進行其他常見呼吸道病毒檢測[6],包括腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒(IFVA和 IFVB型)、副流感病毒(PIV1-3型)、偏肺病毒(HMPV)以了解病毒性病原混合感染的情況；同時對鼻咽抽吸物標本進行了細菌學培養(yǎng),以了解細菌性病原混合感染情況。

1.5 臨床資料分析臨床資料調(diào)查表為根據(jù)研究設(shè)計的統(tǒng)一表格,由采集標本者在采集標本后填寫,結(jié)合檢測結(jié)果,對HCoV-HKU1和HCoV-NL63在呼吸道感染兒童中的臨床和流行病學特點進行總結(jié)分析。

1.6 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0軟件,計量資料采用秩和檢驗,對于計數(shù)資料以Chisquare檢驗或校正Chi-square檢驗進行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 一般資料2009年8月份至2011年7月份共收集1 286份,男性患兒876例,女性患兒410例,男女之比為2.1∶1；鼻咽抽吸物標本795份,咽拭子標本491份,門診采集樣本432例,其中上呼吸道感染339例,下呼吸道感染93例,住院采集樣本854例,均為下呼吸道感染。HCoV-HKU1和NL63總檢出率為2.6%(33/1 286),其中檢測到HCoV-HKU1陽性擴增產(chǎn)物14份,檢出率為1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的陽性擴增產(chǎn)物19份,檢出率為1.5%(19/1 286)。

在HCoV-HKU1陽性病例中,男性患兒10例,女性患兒4例,性別差異在病毒檢出率中無統(tǒng)計學意義(χ2=0.067,P＞0.05)。432例門診患兒檢出HKU1核酸陽性5例,854例住院患兒檢出HKU1核酸陽性9例,門診和住院患兒檢出率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.029,P＞0.05)。陽性病例中位數(shù)年齡為6.8月(1.4月～43月)。其中6個月以下患兒369例,HKU1核酸檢出6例,陽性率1.6%,6個月～12月患兒279例,檢出5例,陽性率1.8%,1歲～3歲患兒285例,檢出2例,陽性率為0.7%,4歲～6歲患兒266例,檢出1例,陽性率為0.38%,6歲以上患兒87例,無陽性標本(季節(jié)分布情況見圖1)

在HCoV-NL63陽性病例中,男性患兒11例,女性患兒8例,性別的差異在病毒檢出率中無統(tǒng)計學意義(χ2=0.928,P＞0.05)。432例門診患兒檢出HCoV-NL63核酸陽性12例,854例住院患兒檢出HCoV-NL63核酸陽性7例,門診和住院患兒檢出率之間差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=146.9,P＜0.05)。陽性病例中位數(shù)年齡為14個月(3.6個月～76個月),其中6個月以下患兒369例,HCoV-NL63核酸檢出3例,陽性率0.8%,6個月～12個月患兒279例,檢出3例,陽性率1.1%,1歲～3歲患兒285例,檢出10例,陽性率為3.5%,4歲～6歲患兒266例,無陽性標本,6歲以上患兒87例,檢出1例,陽性率為1.1%。(季節(jié)分布情況見圖1)

圖1 冠狀病毒HKU1和NL63檢出的季節(jié)分布Fig.1 Seasonal distribution of coronavirus HKU1 and NL63

2.2 臨床特征分析HCoV-HKU1核酸陽性標本均采集于下呼吸道感染病例,臨床診斷包括支氣管炎7例、支氣管肺炎6例、毛細支氣管炎1例,臨床癥狀為咳嗽(100%,14/14)、發(fā)熱(64.3%,9/14)、喘息(57.1%,8/14)、咳痰(57.1%,8/14)；臨床體征為呼吸音增粗(100%,14/14),喘鳴音(50.0%,7/14),痰鳴音(21.4%,3/14),細濕啰音(21.4%,3/14),氣促發(fā)紺(7.1%,1/14),鼻導管吸氧1例,中位數(shù)住院日8 d。無死亡病例。(表1)

HCoV-NL63核酸陽性病例包括門診上呼吸道感染11例和下呼吸道感染1例,住院下呼吸道感染病例7例,臨床診斷為急性上呼吸道感染(57.9%,11/19)、支氣管肺炎(31.6%,6/19)、支氣管炎(5.3%,1/19)、毛細支氣管炎(5.3%,1/19),臨床表現(xiàn)為發(fā)熱(78.9%,15/19)、咳嗽(47.4%,9/19)、咳痰(47.4%,9/19)、喘息(21.1%,4/19)；臨床體征為呼吸音增粗(52.6%,10/19),喘鳴音(26.3%,5/19),痰鳴音(26.3%,5/19)。中位數(shù)住院8 d。無死亡病例。(表1)

HCoV-HKU1與HCoV-NL63陽性病例組間比較臨床癥狀、體征和輔助檢查無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；門診與住院病例、呼吸道感染部位在組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(表1)

2.3 混合感染分析在14份HKU1核酸陽性病例中,1例為單獨感染,13例為病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率92.9%,其中5例為3種病毒混合感染,8例為2種病毒混合感染,最常見的混合感染病毒為人呼吸道合胞病毒(6例),人副流感病毒3型(5例),人腺病毒和人偏肺病毒(各2例)。HKU1陽性病例中9例有細菌混合感染,其中混合感染流感嗜血桿菌4例,肺炎鏈球菌3例(其中1例混合感染金黃色葡萄球菌),卡他布蘭漢菌和聚團泛菌各1例。

表1 HKU1和NL63感染病例的臨床特征Tab.1 Clinical features of coronavirus HKU1 and NL63 infection cases

在19份NL63核酸陽性病例中,7例為單獨感染,12例為病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率為63.2%,其中2例為3種病毒混合感染,10例為2種病毒混合感染,最常見的混合感染病毒為人腺病毒4例,流感病毒A型3例,人博卡病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人副流感病毒1、2、3型和人偏肺病毒各1例。NL63陽性病例中,7例行細菌培養(yǎng)4例有細菌混合感染,其中肺炎鏈球菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、奇異變形菌、奈瑟氏菌各1例。

2.4 基因檢測及分析本研究共檢測出冠狀病毒HKU1陽性擴增產(chǎn)物14份,均在490 bp左右處表現(xiàn)為單一特異性條帶,與預期目的片段聚合酶基因pol片段相符,陽性樣本的測序結(jié)果GenBank中HCoVHKU1基因序列進行Blast比對,核苷酸同源性在98.2%～100%之間。在陽性標本中,2010年采集標本檢出6份,其中A基因型5例,B基因型1例；2011年采集標本檢出8例,A基因型1例,基因型B型7例。冠狀病毒NL63的陽性擴增產(chǎn)物19份,均在250 bp左右處表現(xiàn)為單一特異性條帶,與預期目的片段N基因片段相符,2009年所采集標本檢出13例,2010年所采集標本檢出3例,2011年所采集標本檢出3例,陽性樣本的測序結(jié)果與GenBank中HCoV-NL63基因序列進行Blast比對,核苷酸同源性在95.6%～100%之間。

3 討論

本研究結(jié)果顯示2009—2011年的連續(xù)兩年的流行病學篩查 HCoV-HKU1和 NL63總檢出率為2.6%(33/1 286),HCoV-HKU1檢出率為1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的檢出率為1.5%(19/1 286)。目前世界各地相繼報道有 HCoV-HKU1和HCoV-NL63檢出,陽性率在1% ～10%[7]。HCoVHKU1在各季節(jié)均有檢出,嬰幼兒的感染風險較高,臨床診斷以肺炎居多。與其他呼吸道病毒混合感染較常見。

本研究HCoV-HKU1檢出率1.1%,較蘭州地區(qū)的檢出率為低[8],低于以往南京地區(qū)報道冠狀病毒的總檢出率,但是高于其10歲以下人群的檢出率[9],在檢出率、季節(jié)分布、人群分布與武漢地區(qū)兒童人群報道相似[10]。本研究HCoV-HKU1陽性病例均在下呼吸道感染患兒中檢出,與湖南以往研究一致[11],表明其可能引起病情較重的下呼吸道感染,但因混合感染率92.9%,所以有待更進一步的研究明確其致病性。病毒性病原混合感染分析人呼吸道合胞病毒和人副流感病毒3型是其主要的混合感染病毒性病原,本研究結(jié)果與蘭州地區(qū)的報道一致[8]。本組HCoV-HKU1陽性標本主要分布在冬春季,人群分布以1歲以下嬰幼兒為主,隨著年齡增長檢出率呈下降趨勢。感染患兒的臨床表現(xiàn)無特異性。HCoV-NL63檢出率1.5%,與南京地區(qū)報道的10歲以下人群的檢出率比較為高[9],本組HCoVNL63陽性標本主要分布在夏季和秋季,在8～9月份出現(xiàn)流行高峰,人群分布主要在1歲～3歲幼兒,感染患兒的臨床表現(xiàn)無特異性。本研究較蘭州地區(qū)報道的檢出率低,但季節(jié)分布、人群分布相似[12],但是與廣州地區(qū)在夏季和冬季呈雙流行高峰的季節(jié)分布特點不同[13],分析本研究報道與蘭州地區(qū)檢出率的差異、廣州地區(qū)流行特點的不同可能與地理及氣候因素有關(guān)；與本地區(qū)以往報道的差異可能由研究人群的構(gòu)成不同所導致。本研究HCoV-NL63陽性病例病毒性病原的混合感染率為63.2%,最常見合并感染病毒性病原為人腺病毒和流感病毒A型,分析原因可能是HCoV-NL63與人腺病毒和流感病毒A型流行季節(jié)重疊有關(guān)。

HCoV-HKU1首次被發(fā)現(xiàn)于患有呼吸道和心血管系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病的老年人群中[14],中國香港地區(qū)報道11例兒童感染患兒,8例有基礎(chǔ)疾??；同樣,美國報道的9例HCoV-HKU1感染患兒,5例患有基礎(chǔ)疾病[15]。以上研究表明HCoV-HKU1感染可能會導致基礎(chǔ)疾病的加重而需要住院治療,受感染人群主要為免疫力低下者。本研究的14例HCoV-HKU1感染患兒均為住院患兒,14例陽性病例有11例患兒的年齡小于1歲,因嬰幼兒免疫力尚未發(fā)育成熟,故研究結(jié)果同樣證實HCoV-HKU1感染主要影響免疫力低下的人群。HCoV-NL63感染與呼吸道疾病的致病性已經(jīng)明確,可引起相對溫和的呼吸道感染癥狀如發(fā)熱、咳嗽、咽痛和流涕[16]。本研究HCoVNL63陽性患兒以上呼吸道感染為主,研究結(jié)果與上述報道大致類似。

我們采用RT-PCR方法擴增HCoV-HKU1聚合酶pol和HCoV-NL63的N基因片段,共檢測到33份陽性標本,其中 HCoV-HKU1陽性標本14份,HCoV-NL63陽性標本19份,經(jīng)測序分析分析與已公布的標準株序列同源性在98.2% ～100%和95.6%～100%之間,證實其為冠狀病毒 HCoVHKU1和HCoV-NL63。經(jīng)過進一步系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明,14例HCoV-HKU1核酸陽性樣本種A基因型6例,B基因型8例,在連續(xù)2年的研究中表現(xiàn)出2種基因型交替流行的特點；HCoV-NL63則表現(xiàn)為單一基因型的流行。

綜上所述,通過對南京地區(qū)急性呼吸道感染患兒呼吸道分泌物中HCoV-HKU1和HCoV-NL63基因的檢測和基因分析初步掌握了該病毒在本地區(qū)的臨床和流行病學特征,由于HCoV發(fā)病率較低,陽性病例數(shù)較少,加之本研究的時間短,尚不能完全明確其在兒童急性呼吸道感染中的整體性規(guī)律,需進一步大樣本長時間的廣泛深入研究,以更好地了解HCoV在兒童急性呼吸道感染中的病原學作用和流行病學特征。

利益沖突無