漢麻籽多肽粉經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)研究

宋淑敏，劉宇峰，魏連會，董 艷，潘 靜

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

漢麻（Cannbis sativa L.Hemp）也稱為工業(yè)大麻、火麻，是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻類型，是大麻科大麻屬一年生草本植物[1]。漢麻的根、莖、葉和籽都可以開發(fā)利用，產(chǎn)業(yè)涉及紡織、食品、醫(yī)藥、建材等領(lǐng)域[2]。

漢麻籽具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，漢麻籽中蛋白質(zhì)含量較高，含量為20%～25%，經(jīng)脫脂的漢麻籽粕蛋白質(zhì)含量達(dá)50%以上。漢麻蛋白質(zhì)中含有21種氨基酸，其中包括人體所需的8種氨基酸。漢麻蛋白的65%為麻仁球蛋白，麻仁球蛋白對促進(jìn)消化有很好的作用，另外35%為白蛋白，也是一種優(yōu)質(zhì)蛋白[3]。2002年，衛(wèi)生部將火麻仁（漢麻籽仁）列為“既是食品又是藥品”的目錄，為漢麻籽的食品級應(yīng)用敞開了大門。多肽是蛋白質(zhì)酶解過程的中間產(chǎn)物。研究表明，多肽無論從理化特性、營養(yǎng)特性都顯著優(yōu)于蛋白，多肽具有良好的溶解性、耐酸、熱穩(wěn)定性、黏度低等理化性質(zhì)；比蛋白質(zhì)更易吸收，同時(shí)具有抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、提高免疫力等多種功效[4]。目前，采用酶法制備漢麻籽多肽技術(shù)已經(jīng)成熟[5]，但關(guān)于漢麻籽多肽急性毒性方面的研究還未見報(bào)道，為確保其食用的安全性，對漢麻籽多肽粉的急性毒性進(jìn)行了研究，以期為漢麻籽多肽在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 儀器

MOL-300型全自動生化分析儀，上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FA1104N型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱，上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；BIOQ-MU1000型切向超濾系統(tǒng)，匯和堂生物工程設(shè)備公司產(chǎn)品；VFD-6000型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；Master-DUF型超純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；GL10M大型離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 漢麻籽多肽粉

漢麻籽多肽粉由黑龍江省科學(xué)院大慶分院研制。漢麻籽多肽粉樣品為乳白色粉末狀，無特殊氣味。放置-20℃冰箱中保存，試驗(yàn)時(shí)以蒸餾水制成所需濃度的混懸液。

1.3 試驗(yàn)動物

SPF級KM小白鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，動物合格證號為SCXK（黑） 2013-001。

1.4 試驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)室溫度24±2℃，濕度50%±5%。每只塑料小鼠籠放養(yǎng)5只小鼠，提供符合要求的基礎(chǔ)飼料和清潔水供動物自由攝食、飲用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 漢麻籽多肽制備

以脫脂的漢麻籽粕為原料，采用木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)配水解的方法，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化雙酶水解的酶解條件，提高蛋白的水解度。

2.2 漢麻籽蛋白酶解液的分離純化及冷凍干燥

制備漢麻籽蛋白酶解液經(jīng)滅酶，再以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用離心及超濾系統(tǒng)，利用5 000 Da的超濾膜包，截留分子量為5 000 Da以下的多肽液，進(jìn)一步純化漢麻籽多肽。將5 000 Da以下多肽液放入真空冷凍干燥機(jī)中，進(jìn)行冷凍干燥制備漢麻籽凍干粉，將漢麻籽多肽粉放置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 漢麻籽多肽粉急性毒性試驗(yàn)

依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)》 （GB 15193.3—2014）。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，正式試驗(yàn)采用限量法進(jìn)行試驗(yàn)。健康昆明種小鼠雄、雌各10只，試驗(yàn)前禁食4～6 h，自由飲用清潔水。精確稱取受試樣品20 000 mg加蒸餾水定容至40 mL成均勻懸液，每只小鼠按20 mL/kg·bw體積于12 h內(nèi)經(jīng)口灌胃2次上述樣品的混懸液（此為最大使用濃度和最大灌胃體積，2次灌胃間隔時(shí)間為6 h），2次總劑量達(dá)20 000 mg/kg·bw，末次灌胃1～2 h后喂飼飼料和水。對給予受試物的小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察14 d。記錄小鼠試驗(yàn)時(shí)的初始體重、7 d時(shí)體重及14 d時(shí)體重；觀察并記錄小鼠的中毒癥狀和死亡結(jié)果，對瀕死的小鼠和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活小鼠進(jìn)行主要器官大體病理學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)有可疑病變時(shí)進(jìn)一步做病理組織學(xué)檢查。疑病變時(shí)進(jìn)一步做病理組織學(xué)檢查。

3 結(jié)果分析

3.1 木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)配酶解條件的優(yōu)化

在木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解條件單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用2種酶復(fù)配酶解漢麻籽蛋白的方法，以水解度為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對pH值、酶解溫度、酶添加量進(jìn)行優(yōu)化，料液比1∶5，酶解時(shí)間3 h，篩選中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)配的最佳酶解條件。

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，9個(gè)處理對多肽得率的影響見圖1。

表1 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 9個(gè)處理對多肽得率的影響

由表1和圖1可知，以處理3的水解度、多肽得率較高，分別為22.63%，82.64%。從極差的分析結(jié)果可以看出，影響漢麻蛋白水解度的因素主次關(guān)系為B＞A＞C＞D，溫度對水解度的影響最大，其次是pH值。雙酶復(fù)配酶解的最佳條件組合為A1B3C2D3，即酶解溫度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶添加量0.4%，中性蛋白酶添加量3.0%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該工藝條件下的DH為27.23%，多肽得率85.64%。

3.2 多肽的分離純化及冷凍干燥

將漢麻籽蛋白酶解液經(jīng)轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min，收集上清液。通過切向流超濾系統(tǒng)，截留分子量5000Da以下的小分子肽。超濾系統(tǒng)的壓力在0.8～1.0 Bar，流速0.93 r/min。將分子量5 000 Da以下和5 000 Da以上的多肽液放入真空冷凍干燥機(jī)中分別進(jìn)行低溫冷凍干燥，制備漢麻籽多肽凍干粉。結(jié)果表明，分子量5 000 Da以下小分子肽占多肽總量的90%以上。

3.3 漢麻籽多肽粉急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)》 （GB 15193.3—2014），采用限量法對每只小鼠按20 mL/kg·bw體積于12 h內(nèi)經(jīng)口灌胃2次上述漢麻籽多肽粉的混懸液，2次總劑量達(dá)20 000 mg/kg·bw，末次灌胃1～2 h后喂飼飼料和水。對受試小鼠行為、體重、死亡情況進(jìn)行連續(xù)14 d觀察，14 d后對受試小鼠進(jìn)行大體病理學(xué)觀察。

3.3.1 小鼠的行為

在14 d的觀察期內(nèi)，小鼠活動、反應(yīng)正常，進(jìn)食、大小便正常，未見腹瀉、呼吸困難、流血、流鼻涕等異?，F(xiàn)象。

3.3.2 小鼠體重變化

漢麻籽多肽粉小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)體重變化結(jié)果見表2。

表2 漢麻籽多肽粉小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)體重變化結(jié)果

由表2的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在灌胃劑量為20 000 mg/kg·bw，通過對小鼠的初始體重、7 d時(shí)體重、14 d時(shí)體重的記錄。結(jié)果表明，灌胃雌、雄小鼠均未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，體重均正常增長。

3.3.3 小鼠死亡情況

對給予灌胃劑量20 000 mg/kg·bw的雌、雄各10只小鼠，進(jìn)行14 d的觀察，20只小鼠全部存活，未發(fā)現(xiàn)死亡小鼠。

漢麻籽多肽粉小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

3.3.4 病理學(xué)檢查

表3 漢麻籽多肽粉小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束后，對受試小鼠的主要器官進(jìn)行大體病理學(xué)檢查，主要對小鼠的心臟、肝臟、脾、腎、胃等器官進(jìn)行病理學(xué)檢查，未見臟器異常改變。解剖小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾、胃等器官的形狀、大小、表面黏膜附著情況均正常，無病理病變。

綜上，小鼠經(jīng)口灌胃受試物后，連續(xù)觀察14 d未見任何中毒癥狀和表現(xiàn)，亦無死亡發(fā)生；對所有存活動物進(jìn)行大體病理學(xué)觀察，未見臟器異常改變。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，對受試小鼠進(jìn)行連續(xù)14d的觀察，未見任何中毒癥狀和表現(xiàn)，亦無死亡發(fā)生；對小鼠進(jìn)行大體病理學(xué)觀察，未見臟器異常改變。根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)》 （GB 15193.3—2014） 附錄G急性毒性（LD50）劑量分級表及試驗(yàn)結(jié)果，受試樣品漢麻籽多肽粉對雌、雄小鼠經(jīng)口LD50均大于20 000 mg/kg·bw，屬實(shí)際無毒物質(zhì)，證明酶法制備的漢麻籽多肽具有良好的食用安全性。研究為漢麻籽多肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[3]何錦鳳，張琨，陳天鵬.漢麻籽的營養(yǎng)成分和功能 [J].食品科技，2007（6）：258-259.

[4]孔令明，李芳，陶永霞，等.多肽的功能活性與研究進(jìn)展 [J].中國食品添加劑，2009（3）：71-72.

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