苦豆子生物堿浸提物的抑菌性研究

余永婷，馮作山

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830021；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

0 引言

苦豆子（Sophora alopecuraides L.）屬于豆科槐屬，又稱苦豆根、歐苦參、苦豆草、西豆根、苦甘草等[1]，西北區(qū)域?yàn)榭喽棺又鳟a(chǎn)區(qū)。其所含有效成分中包含較多生物堿，生物堿總量在全草、種子中的占比分別達(dá)6.11%～8.03%，8.11%，所含生物堿20多種，包括氧化槐堿、金雀花堿、氯化苦參堿、苦豆堿、槐定堿、苦參堿與槐果堿等[2]。基于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)，苦豆子味苦性寒，具備解毒、利尿退黃、祛濕清熱等功效。通過對苦豆子進(jìn)行現(xiàn)代藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其所含藥物活性物質(zhì)是苦參堿類，此生物堿具備諸多功效，如清熱燥濕、降血脂降壓、殺蟲、降溫鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗?jié)儭⒖寡?、抗腹瀉與利尿等[3]?，F(xiàn)今，在研究與應(yīng)用苦豆子方面，全球都將生物堿作為重點(diǎn)。試驗(yàn)對苦豆子生物堿抑菌性展開測定，對其抑菌效應(yīng)進(jìn)行觀察，研究此藥物生物堿的抑菌功能，可將研究結(jié)果作為理論依據(jù)供苦豆子在防腐、食品保鮮和醫(yī)藥價(jià)值研發(fā)所需。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

苦豆子來源于新疆，所用菌株由微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcu saurers）、枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）；酵母菌：釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）；霉菌：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor）/黑曲霉（Aspergillus sp.）。

培養(yǎng)基：察氏瓊脂/牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。

1.2 儀器設(shè)備

電子天平、722型可見光分光光度儀、電熱恒溫水浴鍋、N-1001型系列EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DZF-6090型真空干燥箱、DELTA320型pH計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-SG-280型醫(yī)用殺菌鍋等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 提取苦豆子生物堿的浸提物和制劑的制備[4-5]

精準(zhǔn)稱量0.1 kg苦豆子粉，在室溫下，由酸性乙醇溶劑對其浸泡4次，4 d/次。回收溶劑，接著進(jìn)行真空干燥，獲得總浸提物，然后依次通過脫脂處理、酸化處理、堿化處理、氯仿萃取處理環(huán)節(jié)，獲得苦豆子生物堿提取物。精準(zhǔn)稱量10 g苦豆子生物堿，放在燒杯內(nèi)，滴加2 mL鹽酸溶液（10 mL/L）使其溶解，加蒸餾水至80 mL，加4 g活性炭，煮沸15 min，過濾澄清后濾液加蒸餾水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值5～6，于100℃條件下滅菌30 min后備用。

2.2 苦豆子生物堿浸提物的抑菌試驗(yàn)[6-7]

常用的濾紙片法測定苦豆子生物總堿的抑菌作用：借助打孔器，把定性濾紙制作為小圓片（φ9 mm），然后置于培養(yǎng)皿內(nèi)，于高壓條件下實(shí)施滅菌處理。分別把經(jīng)過滅菌的濾紙片置于下述3類溶液內(nèi)進(jìn)行浸泡：①0.1 mg/mL的苦豆子生物堿液；②無菌水；③0.1%的苯甲酸鈉溶液。均進(jìn)行12 h充分浸泡。分別吸取各菌懸液100μL，于無菌環(huán)境中，放置在已預(yù)先制備的培養(yǎng)基平板內(nèi)，在三角刮鏟協(xié)助下，做到均勻涂布。然后，借助經(jīng)過滅菌處理的鑷子夾取已浸透的濾紙片貼于已接種的平板上，將培養(yǎng)皿背側(cè)劃分出3個部分（面積相等），將含苦豆子生物堿提取物濾紙片貼在其中一部分上，一部分則貼無菌水浸過的濾紙片作對照試驗(yàn)，剩余部分貼含0.1%無菌苯甲酸鈉的濾紙片，2片濾紙需保持一定間距。然后，把此平板置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，將酵母菌置于30±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；細(xì)菌培養(yǎng)時間18～24 h，溫度36±1℃；霉菌培養(yǎng)時間48 h，溫度28±1℃。對各抑菌圈直徑進(jìn)行測量，為了獲得準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)，各菌需安排3個重復(fù)。

2.3 苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響[8]

2.3.1 pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

在無菌操作條件下，分別移取10 mL稀釋過的苦豆子生物堿液于7個無菌小燒杯中，在這些小燒杯內(nèi)分別加入一定濃度的氫氧化鈉或鹽酸溶液，以此調(diào)節(jié)苦豆子生物堿提取液酸堿度，其中pH值最低為4.0，最高為10.0，二者之間的pH值還有5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，借助采取同以上濾紙片法一致操作，平行操作2次，求其平均值，比較不同的pH值對苦豆子生物堿提取液抑菌活性的影響。

2.3.2 溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌的影響

在無菌操作條件下，分別移取5 mL苦豆子生物堿提取液于5個無菌小燒杯中，把濾紙片分別放入25，76，100，121℃的水浴中加熱的燒杯中加熱2 h；接著采用以上濾紙片法一致操作，進(jìn)行2次平行操作，以均值為準(zhǔn)，針對溫度影響此提取液抑菌活性程度展開對比分析。

2.4 苦豆子生物堿浸提物對致病菌作用時間與抑菌率的關(guān)系[9]

分別測定不同濃度的苦豆子生物堿提取液對革蘭氏陽性菌的枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作用時間與抑菌率之間的關(guān)系。在無菌操作條件下，分別用0.1 mL枯草芽孢桿菌和0.1 mL大腸桿菌懸液與2倍稀釋法稀釋好的苦豆子生物堿提取液1 mL充分混合，設(shè)定作用時間為1，3，6，9，12 h；吸取0.2 mL混合菌懸液移至無菌平皿內(nèi)，再將固體培養(yǎng)基（溫度為60℃上下）倒入，徹底混勻，靜置凝固，然后倒置在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行1 d培養(yǎng)，溫度為37℃。另外，在0.1 mL大腸桿菌懸液與0.1 mL枯草芽孢桿菌懸液內(nèi)分別滴加0.2 mL無菌水，且分別混勻，將固體培養(yǎng)基倒入，將所制平板當(dāng)做對照，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 d培養(yǎng)，溫度37℃；對菌落數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)，采取以上濾紙片法，進(jìn)行2次平行重復(fù)操作，同時通過公式（1），對抑菌率進(jìn)行求解。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦豆子生物堿浸提物的抑菌作用

苦豆子生物堿浸提物對試驗(yàn)菌的抑制效果見表1。

表1 苦豆子生物堿浸提物對試驗(yàn)菌的抑制效果（抑菌圈大小）/mm

由表1可知，苯甲酸鈉與苦豆子生物堿浸提物抑菌作用之相比，抑菌效果較差。苦豆子生物堿浸提物具備一定抑菌功能，包括細(xì)菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌。其中，后2種抑制作用更為突出。此次試驗(yàn)所涉及菌種有3類，此浸提物可明顯抑制的為黑曲霉，抑制根霉與毛霉效果不明顯。

3.2 苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

3.2.1 不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響見表2。

由表2可知，在較高溫度下，苦豆子生物堿浸提物呈現(xiàn)出一定穩(wěn)定性。在溫度提高后，抑菌能力隨之增強(qiáng)。導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能為此浸提物在溫度提升下濃度變大，從而抑菌能力提升。

表2 不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

3.2.2 不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響見表3。

表3 不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

由表3可看出，當(dāng)苦豆子生物堿所處環(huán)境pH值為8時，抑菌作用最突出。

3.3 苦豆子生物堿浸提物對致病菌作用時間與抑菌率的關(guān)系

不同質(zhì)量濃度的苦豆子生物堿浸提物對大腸桿菌作用時間與抑菌率的關(guān)系見圖1，不同質(zhì)量濃度的苦豆子生物堿浸提物對枯草芽孢桿菌作用時間與抑菌率的關(guān)系見圖2。

圖1 不同質(zhì)量濃度的苦豆子生物堿浸提物對大腸桿菌作用時間與抑菌率的關(guān)系

由圖1和圖2可知，在同一質(zhì)量濃度的苦豆子生物堿浸提物作用時間越長，其抑菌率也越高；而且相同時間內(nèi)，苦豆子生物堿浸提物的質(zhì)量濃度越高，抑菌率越高。就大腸桿菌與枯草芽孢桿菌而言，相比革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌的抑制性更強(qiáng)。

4 結(jié)論

圖2 不同質(zhì)量濃度的苦豆子生物堿浸提物對枯草芽孢桿菌作用時間與抑菌率的關(guān)系

通過此次抑菌試驗(yàn)可知，苦豆子生物堿浸提物對細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑制效應(yīng)，針對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、金黃色葡萄球菌，所對應(yīng)的MIC值依次是12.50，5.25，5.25，25.00μg/mL。在此浸提物抑菌效果上，相比細(xì)菌，對酵母菌未表現(xiàn)出顯著抑制性，對應(yīng)酵母菌的MIC值是25μg/mL，就試驗(yàn)所涉及的3類菌種而言，可有效抑制黑曲霉，未見明顯抑制根霉與毛霉。

對于苦豆子生物堿浸提物抑菌效果而言，溫度越高，苦參堿的抑菌效果越顯著；在不同的pH值范圍內(nèi)均較穩(wěn)定，在弱堿性條件下（pH值8左右） 其抑菌作用較好；當(dāng)作用時間既定時，抑菌效果隨著質(zhì)量濃度的提升而愈加明顯；當(dāng)質(zhì)量濃度一定時，作用時間愈長，抑菌效果越明顯。通過對比此浸提物分別抑制枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的表現(xiàn)可知，相比革蘭氏陰性菌，其抑制革蘭氏陽性菌的作用較強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典 [M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1997：1 293-1 294.

[2]張?zhí)m珍，李家實(shí).苦豆子種子生物堿成分研究 [J].中國中藥雜志，1997，22（12）：740-743.

[3]熊鑫，郭樹奇，李琳.苦豆子生物堿對番茄生長及果實(shí)品質(zhì)的影響 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（9）：1 737-1 746.

[4]秦學(xué)功，元英進(jìn).苦豆子種子中生物堿的冷浸提取試驗(yàn)研究 [J].中草藥，2001，32（7）：604-606.

[5]趙輝，趙志剛.苦豆籽中總生物堿的含量測定 [J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2001，13（2）：211-212.

[6]魏玉西，帥莉，郭道森，等.辣椒堿的抑菌活性研究 [J].食品科學(xué)，2006，27（8）：76-78.

[7]濃萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) [M].北京：高等教育出版社，2015：75-80.

[8]邸大琳，李法慶，陳蕾，等.苦參體外抑菌作用的研究 [J].時珍國醫(yī)國藥，2006，10（17）：1 974-1 975.

[9]張義英，王俊儒，龔月樺，等.駱駝蓬醇提物抑菌活性的初步研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，11（34）：122-125.◇