大鯢體表黏液透明質(zhì)酸提取及其抗氧化活性的研究

于海慧，李 偉，佟長青

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023）

0 引言

大鯢具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，隨著水生野生動物特許利用政策的出臺，養(yǎng)殖大鯢在我國各地得到普遍推廣，逐漸成為一種極具市場前景的新興養(yǎng)殖品種[1-2]。大鯢真皮內(nèi)分布有大量的多細(xì)胞腺體，主要為黏液腺和顆粒腺，其中黏液腺遍布全身，可分泌出大量的濕滑黏液。陳德經(jīng)等人[3]采用水提取、堿提取、酸提取和酶提取等方法，從大鯢黏液中提取出粗多糖，其單糖組分為甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖。葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖為透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）的組成單元。因此，大鯢皮膚及其黏液是透明質(zhì)酸的潛在來源。不同來源的純的HA結(jié)構(gòu)完全相同，僅在相對分子量大小上存在差異，具有良好的生物相容性，作為一種可吸收、可降解的生物材料，已在藥物、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[4]。

自由基具有極強(qiáng)的氧化性，生物體生化反應(yīng)常常會導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生[5]，進(jìn)而造成重要的生物大分子的損傷，使機(jī)體承擔(dān)患病風(fēng)險[6]。關(guān)于透明質(zhì)酸抗氧化作用的相關(guān)報道已有很多。例如，李密等人[7]從烏賊眼中提取出的HA-1和HA-2，在質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除·OH和DPPH·的能力也增強(qiáng)。于樂惠等人[8]監(jiān)測了關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉4周后患者關(guān)節(jié)液中超氧化物歧化酶（SOD） 和丙二醛（MDA） 含量的變化，發(fā)現(xiàn)SOD含量明顯上升，MDA含量明顯下降（p＜0.05或p＜0.01）。馮寧等人[9]研究了口服HA后血清SOD活性，發(fā)現(xiàn)HA具有體內(nèi)抗氧化作用。

以往對大鯢的研究，主要集中在肉、皮的粗加工和酶解獲取活性肽等，而對從大鯢中提取HA及其抗氧化活性的研究報道較少。以大鯢體表黏液為原料，進(jìn)行大鯢體表黏液中透明質(zhì)酸提取工藝研究，同時對大鯢體表黏液透明質(zhì)酸進(jìn)行體外抗氧化評價，以期更好地利用大鯢資源，為大鯢深加工提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢黏液，張家界（中國）金馳大鯢生物科技有限公司提供；TSK-gel G4000 PWXL型色譜柱，日本TOSOH公司提供；2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·） （AR）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid） diammonium salt，ABTS） （AR），美國 Sigma公司提供；DEAE-纖維素DE-52，北京索萊寶科技有限公司提供；胰蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢黏液預(yù)處理

冷凍保藏的大鯢黏液解凍后，加入生理鹽水（1∶2，m/V），勻漿后備用。

1.2.2 酶解提取透明質(zhì)酸的方法

勻漿后的大鯢黏液，調(diào)節(jié)溶液pH值，加入蛋白酶酶解，酶解后于100℃條件下處理5 min。冷卻至室溫后，以轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心15 min，上清液加入2倍體積95%的乙醇，于3℃條件下沉淀24 h。沉淀用0.1 mol/L NaCl溶解，調(diào)pH值至4.5，加入1/4體積氯仿/正丁醇（4∶1，V/V） 混合液除蛋白3次。上清液加入2倍體積的95%乙醇，于3℃條件下靜置12 h后離心，沉淀以蒸餾水溶解，冷凍干燥，得大鯢透明質(zhì)酸粗提物。

1.2.3 DE-52分離透明質(zhì)酸

以去離子水洗脫DEAE-纖維素DE-52柱（φ15×150）至平衡。將5.0 mg/mL的大鯢透明質(zhì)酸粗提物溶液通過孔徑0.45μm針筒式無機(jī)膜過濾后，取2.0 mL濾液上樣，以1 mL/min去離子水洗脫，40管后，以0～1 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫。以間羥基聯(lián)苯法[10]和苯酚-硫酸法分別檢測各接收管溶液中葡萄糖醛酸、總糖量，收集葡萄糖醛酸/總糖為35%～48%洗脫液，透析凍干，得到純化后的大鯢HA樣品。

1.2.4 HA得率的測定

HA得率（濕基）計算公式如下：

HA得率=葡萄糖醛酸質(zhì)量/0.483 8/大鯢黏液質(zhì)量×100%.

1.2.5 透明質(zhì)酸性質(zhì)

將干燥的HA樣品與KBr混勻后壓片，并通過Frontier FT-IR光譜儀（Perkin-Elmer） 測定樣品的FT-IR光譜。

HA樣品以D2O溶解，樣品質(zhì)量濃度為20 mg/mL，于25～28℃，500 MHz條件下，在Varian Unity 500核磁共振譜儀上進(jìn)行13CNMR檢測。

使用雙蒸水配制5 mg/mL分子量分別為10 000，70 000，500 000，2 000 000 Da的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液和大鯢HA溶液，以孔徑0.45μm無機(jī)膜過濾后，使用TSK-gel G4000 PWXL色譜柱，通過高效液相色譜儀，以0.6 mL/min雙蒸水洗脫，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算大鯢HA分子量。

1.2.6 抗氧化活性測定

DPPH·清除能力測定采用Cotelle N等人[11]的方法，·OH清除能力測定采用趙翾等人[12]的方法，ABTS+·清除能力測定采用Miller N等人[13]的方法，還原力測定采用Hinneburg I等人[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響

胰蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響見圖1。

圖1 胰蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響

由圖1（a）可知，隨著胰蛋白酶添加量的增加，HA得率也隨之增加，這是因為酶添加量的增加會增大其相互作用的接觸面積，也就使酶解速率加快。當(dāng)酶添加量為2%時，HA得率達(dá)到最大值，但酶添加量繼續(xù)增加時HA得率反而減少。由圖1（b） 可知，隨酶解pH值的增加HA得率也逐漸增加，當(dāng)pH值為8時HA得率最大，這是由于在pH值8時，胰蛋白酶處于一種解離狀態(tài)，最有利于與大鯢黏液中蛋白質(zhì)的結(jié)合并發(fā)生催化作用，活力最高。隨著pH值繼續(xù)增加HA得率逐漸減少，可能是由于溶液堿性過大而破壞HA的穩(wěn)定性。由圖1（c）可知，HA得率會隨著酶解溫度的升高而逐漸升高，這是由于溫度的升高可以增加反應(yīng)速率，當(dāng)酶解溫度為37℃，HA得率達(dá)到最大值，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時，HA得率逐漸下降。從圖1（d） 可以看出，隨著酶解時間的增加，HA得率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在3 h時，HA得率為最大值。這可能是由于時間過長，使透明質(zhì)酸被降解。

2.2 最佳提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，在pH值8.0時，考查酶解時間、酶解溫度、酶添加量3個因素對HA得率的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計L9（34）正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表1，顯著性檢驗見表2。

表1 正交試驗結(jié)果

表2 顯著性檢驗

極差分析結(jié)果表明，正交試驗中最佳因素組合為A3B2C1，即酶解時間4 h，酶解溫度37℃，酶添加量1.5%。顯著性檢驗結(jié)果表明，酶添加量對于大鯢HA得率影響小，作為誤差項，而酶解溫度和酶解時間影響較大，但不顯著。

2.3 大鯢透明質(zhì)酸粗提物純化

大鯢黏液透明質(zhì)酸DE-52陰離子交換層析見圖2。

圖2 大鯢黏液透明質(zhì)酸DE-52陰離子交換層析

由圖2可以看出，在以0～1 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫時，總糖曲線有2個主要峰。這2個峰的葡萄糖醛酸占總糖分別為44.76%和12.94%。100 mg透明質(zhì)酸完全水解，可以得到48.38 mg葡萄糖醛酸，因此，粗大鯢透明質(zhì)酸經(jīng)DE-52分離后，收集梯度洗脫第1個峰，經(jīng)透析凍干后，得到的透明質(zhì)酸相對較純。

2.4 大鯢HA性質(zhì)

大鯢HA的FT-IR見圖3。

圖3 大鯢HA的FT-IR

由圖3可以看出，在波數(shù)3 400～3 230 cm-1有較強(qiáng)的吸收峰，峰值處于3 319 cm-1，為醇羥基的O-H伸縮振動特征峰，在1 171 cm-1處的吸收峰為醇羥基的C-OH伸縮振動特征峰，在波數(shù)3 570～3 050 cm-1出現(xiàn)了寬的吸收帶，表明存在多個O-H伸縮振動吸收峰的疊加，表明存在多個醇羥基；在波數(shù)1 420～1 390 cm-1的吸收峰峰值處于1 396 cm-1，為羧基的對稱伸縮峰；在波數(shù)1 560～1 530 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，主要為仲酰胺R1-NH-CO-R2中NH面內(nèi)變角振動；在波數(shù)1 239 cm-1的吸收峰為仲酰胺R1-NH-CO-R2的特征吸收峰，即酰胺III吸收帶，為C-N伸縮振動特征峰，表明存在仲酰胺基團(tuán)。與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)透明質(zhì)酸鈉相比，大鯢HA各基團(tuán)出峰位置基本一致，這與陰離子柱DE-52結(jié)果（即葡萄糖醛酸占總糖44.76%）一致，也說明了所提取到的為較純的大鯢透明質(zhì)酸。

大鯢HA13C-NMR見圖4。

圖4 大鯢HA13C-NMR

δ100.2×10-6為異頭碳信號，δ55.34×10-6為C2信號，δ84.75×10-6為C3信號，δ70.29×10-6為C4信號，δ76.41×10-6為C5信號，δ61.34×10-6為 C6信號，δ174.83×10-6反映 C=O信號，δ24.99 ppm為CH3信號[15]。

通過HPLC，以保留時間為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-0.244 1X+8.700 9（R2=0.997），進(jìn)而得出大鯢HA分子量為4.85×106Da。

2.5 抗氧化活性

大鯢透明質(zhì)酸清除DPPH·能力見圖5。

圖5 大鯢透明質(zhì)酸清除DPPH·能力

由圖5可以看出，大鯢HA清除DPPH·，·OH，ABTS+·和還原Fe3+能力具有濃度依賴性，即隨著HA質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，其清除自由基IC50分別為8.13，12.10，7.00 mg/mL。Sadhasivam G 等人[16]發(fā)現(xiàn)海洋黃貂魚（Aetobatus narinari）肝臟中分離的HA具有清除DPPH·的能力。Kanchana等人發(fā)現(xiàn)Amussium pleuronectus（Linnaeus，1758） 也具有清除DPPH·的能力。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定了從大鯢黏液中提取透明質(zhì)酸的最佳工藝條件為使用胰蛋白酶，酶添加量1.5%，pH值8.0，酶解溫度37℃，酶解時間4 h。在該工藝條件下，HA得率為1.704 1 mg/g，分子量約為4.85×106Da。紅外光譜分析表明大鯢HA與透明質(zhì)酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置基本一致。13C-NMR譜表明大鯢透明質(zhì)酸含有異頭碳。大鯢黏液透明質(zhì)酸具有一定的體外抗氧化活性，能夠清除DPPH·，·OH，ABTS+·和還原 Fe3+。

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