單核細胞增生李斯特氏菌國家標準檢驗方法的驗證與探討

□ 馬 源 邊芝慧 趙 苑 陜西省榆林市榆陽區(qū)食品檢驗檢測中心

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是李斯特氏菌屬中唯一具有致病性，也是致病力最強的細菌，是一種人畜共患的病原菌。它可以穿過宿主三個屏障，即腸屏障、血腦屏障和胎盤屏障，然其引起的疾病的發(fā)生率不高，但死亡率可達20%～30%[1]。單增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活，是對人類健康危害最大的一種。在4 ℃的儲存條件下依然能夠生存繁殖，主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌臘食品、西紅柿、沙拉、水產(chǎn)品等中。在我國，食品中單增李斯特菌要求為不得檢出。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

本實驗室提供的食品樣品，編號YYSJ-2019-003。

1.1.2 主要儀器設備

生物安全柜（HR60-ⅡA2）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LHS-250SC）、全自動微生物生化鑒定儀（VITEK 2COMPACT）、醫(yī)用冷藏箱（HYC-390）和正置生物顯微鏡（BX43）。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂、SIM動力培養(yǎng)基、血平板，北京陸橋技術有限公司；李氏增菌肉湯（LB1、LB2）、TSA-YE，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；單增李斯特氏菌生化鑒定試劑盒（比色法），法國Bio Meriuex公司；標準菌株單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、斯氏李斯特氏菌（ATCC35967）、伊氏李斯特氏菌（ATCC19118）、馬紅球菌（ATCC6939）、英諾克李斯特氏菌（ATCC33090），美國菌株保藏中心（ATCC）。試驗中涉及的試劑和培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)并受質(zhì)量控制。

1.2 方法

按國家標準檢驗檢測方法GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精燈對樣品表面進行燒灼消毒，之后用無菌剪刀切割并取樣25 g深層肌肉，然后加入225 mL LB1增菌液，30 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)24 h。在李斯特氏菌顯色平板以及PALCAM平板上，通過接種環(huán)將LB2增菌液以劃線方式接種，并于36 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24～48 h；同時，接種單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、馬紅球菌標準菌株[3]，分別作為陽性對照和陰性對照。從李斯特氏菌顯色平板、PALCAM瓊脂平板上取5個以上的可疑菌落，然后，將菌落接種于木糖、鼠李糖中，在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h；并在TSA-YE培養(yǎng)基上純培養(yǎng)后，再按照染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的順序進行操作。最后，使用李斯特氏菌屬鑒定試劑盒和全自動微生物生化鑒定儀鑒定了TSA-YE上純培養(yǎng)的菌株。

2 結(jié)果

2.1 選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

5個PALCAM培養(yǎng)基平板上菌落略微凸起，灰綠色菌落，表面光滑、濕潤、邊緣整齊，形態(tài)一致，周圍有棕黑色水解圈；而實驗樣品和單增李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上為藍綠色菌落，圓形、光滑的表面，邊緣整齊、周圍有白色暈圈，伊氏李斯特氏菌菌落形態(tài)與之相似；斯氏李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌菌落形態(tài)與單增李斯特氏菌相似，只是菌落周圍沒有水解圈。

2.2 菌株生化特征

實驗樣品及四種李斯特氏菌標準菌株生化反應中，與葡萄糖、MR-VP、麥芽糖、七葉苷、甘露醇等具有相同的反應結(jié)果。另外，與木糖反應結(jié)果中，除伊氏李斯特氏菌的木糖反應為陽性，其他都為陰性。其中，通過溶血反應區(qū)分單增細胞李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌，并且通過協(xié)同溶血反應進一步證實英諾克李斯特氏菌的不溶血現(xiàn)象。使用木糖和鼠李糖發(fā)酵管反應，可以將單增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、斯式李斯特氏菌區(qū)分開，見表1。

2.3 生化鑒定結(jié)果

經(jīng)由李斯特氏菌屬生化鑒定板條的10種生化反應，鑒定實驗樣本和李斯特氏菌屬，見表2。

2.4 VITEK 2COMPACT鑒定結(jié)果

通過全自動微生物生化鑒定儀檢測得出，四種標準菌株以及實驗樣品均被鑒定為李斯特氏菌屬，但無法鑒定李斯特氏菌種。

表1 實驗樣本及李斯特氏菌屬標準對照菌株的生化特征

表2 李斯特氏菌屬鑒定試劑盒鑒定結(jié)果

3 討論

通過一系列驗證單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法GB4789.30-2016，利用李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基進行選擇性分離培養(yǎng)，可通過菌落形態(tài)進行初步區(qū)分，排除不必要的雜菌，再用木糖、鼠李糖發(fā)酵管等生化反應區(qū)分單增李斯特氏菌與伊氏李斯特氏菌。單增李斯特氏菌與其他李斯特氏菌種通過溶血試驗和協(xié)同溶血試驗來區(qū)分和確認。溶血試驗中所使用血平板的厚度對試驗結(jié)果有較大影響，若血平板過厚，如每皿瓊脂量大于20 mL會使血平板于明亮處不能透視觀察協(xié)同溶血反應；若血平板過薄，則穿刺易刺到底，直接影響溶血現(xiàn)象，溶血環(huán)不易確定；因此血平板的薄厚應以每皿15～20 mL瓊脂量為宜。另外，可同時使用李斯特氏菌屬鑒定試劑盒進行生化鑒定，通過API Listeria圖譜結(jié)果區(qū)分單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，進一步證實了選擇性平板分離培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)果的準確性。此方法省去了溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的鑒定步驟，使檢測效率提高的同時也提升了檢測的準確度。