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    單核細胞增生李斯特氏菌國家標準檢驗方法的驗證與探討

    2018-05-25 02:20:10邊芝慧陜西省榆林市榆陽區(qū)食品檢驗檢測中心
    食品安全導刊 2018年36期
    關鍵詞:諾克單增氏菌

    □ 馬 源 邊芝慧 趙 苑 陜西省榆林市榆陽區(qū)食品檢驗檢測中心

    單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是李斯特氏菌屬中唯一具有致病性,也是致病力最強的細菌,是一種人畜共患的病原菌。它可以穿過宿主三個屏障,即腸屏障、血腦屏障和胎盤屏障,然其引起的疾病的發(fā)生率不高,但死亡率可達20%~30%[1]。單增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活,是對人類健康危害最大的一種。在4 ℃的儲存條件下依然能夠生存繁殖,主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌臘食品、西紅柿、沙拉、水產(chǎn)品等中。在我國,食品中單增李斯特菌要求為不得檢出。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料來源

    本實驗室提供的食品樣品,編號YYSJ-2019-003。

    1.1.2 主要儀器設備

    生物安全柜(HR60-ⅡA2)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LHS-250SC)、全自動微生物生化鑒定儀(VITEK 2COMPACT)、醫(yī)用冷藏箱(HYC-390)和正置生物顯微鏡(BX43)。

    1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

    李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂、SIM動力培養(yǎng)基、血平板,北京陸橋技術有限公司;李氏增菌肉湯(LB1、LB2)、TSA-YE,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;單增李斯特氏菌生化鑒定試劑盒(比色法),法國Bio Meriuex公司;標準菌株單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC19115)、斯氏李斯特氏菌(ATCC35967)、伊氏李斯特氏菌(ATCC19118)、馬紅球菌(ATCC6939)、英諾克李斯特氏菌(ATCC33090),美國菌株保藏中心(ATCC)。試驗中涉及的試劑和培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)并受質(zhì)量控制。

    1.2 方法

    按國家標準檢驗檢測方法GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精燈對樣品表面進行燒灼消毒,之后用無菌剪刀切割并取樣25 g深層肌肉,然后加入225 mL LB1增菌液,30 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL,轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi),30 ℃培養(yǎng)24 h。在李斯特氏菌顯色平板以及PALCAM平板上,通過接種環(huán)將LB2增菌液以劃線方式接種,并于36 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24~48 h;同時,接種單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、馬紅球菌標準菌株[3],分別作為陽性對照和陰性對照。從李斯特氏菌顯色平板、PALCAM瓊脂平板上取5個以上的可疑菌落,然后,將菌落接種于木糖、鼠李糖中,在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h;并在TSA-YE培養(yǎng)基上純培養(yǎng)后,再按照染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的順序進行操作。最后,使用李斯特氏菌屬鑒定試劑盒和全自動微生物生化鑒定儀鑒定了TSA-YE上純培養(yǎng)的菌株。

    2 結(jié)果

    2.1 選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

    5個PALCAM培養(yǎng)基平板上菌落略微凸起,灰綠色菌落,表面光滑、濕潤、邊緣整齊,形態(tài)一致,周圍有棕黑色水解圈;而實驗樣品和單增李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上為藍綠色菌落,圓形、光滑的表面,邊緣整齊、周圍有白色暈圈,伊氏李斯特氏菌菌落形態(tài)與之相似;斯氏李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌菌落形態(tài)與單增李斯特氏菌相似,只是菌落周圍沒有水解圈。

    2.2 菌株生化特征

    實驗樣品及四種李斯特氏菌標準菌株生化反應中,與葡萄糖、MR-VP、麥芽糖、七葉苷、甘露醇等具有相同的反應結(jié)果。另外,與木糖反應結(jié)果中,除伊氏李斯特氏菌的木糖反應為陽性,其他都為陰性。其中,通過溶血反應區(qū)分單增細胞李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌,并且通過協(xié)同溶血反應進一步證實英諾克李斯特氏菌的不溶血現(xiàn)象。使用木糖和鼠李糖發(fā)酵管反應,可以將單增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、斯式李斯特氏菌區(qū)分開,見表1。

    2.3 生化鑒定結(jié)果

    經(jīng)由李斯特氏菌屬生化鑒定板條的10種生化反應,鑒定實驗樣本和李斯特氏菌屬,見表2。

    2.4 VITEK 2COMPACT鑒定結(jié)果

    通過全自動微生物生化鑒定儀檢測得出,四種標準菌株以及實驗樣品均被鑒定為李斯特氏菌屬,但無法鑒定李斯特氏菌種。

    表1 實驗樣本及李斯特氏菌屬標準對照菌株的生化特征

    表2 李斯特氏菌屬鑒定試劑盒鑒定結(jié)果

    3 討論

    通過一系列驗證單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法GB4789.30-2016,利用李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基進行選擇性分離培養(yǎng),可通過菌落形態(tài)進行初步區(qū)分,排除不必要的雜菌,再用木糖、鼠李糖發(fā)酵管等生化反應區(qū)分單增李斯特氏菌與伊氏李斯特氏菌。單增李斯特氏菌與其他李斯特氏菌種通過溶血試驗和協(xié)同溶血試驗來區(qū)分和確認。溶血試驗中所使用血平板的厚度對試驗結(jié)果有較大影響,若血平板過厚,如每皿瓊脂量大于20 mL會使血平板于明亮處不能透視觀察協(xié)同溶血反應;若血平板過薄,則穿刺易刺到底,直接影響溶血現(xiàn)象,溶血環(huán)不易確定;因此血平板的薄厚應以每皿15~20 mL瓊脂量為宜。另外,可同時使用李斯特氏菌屬鑒定試劑盒進行生化鑒定,通過API Listeria圖譜結(jié)果區(qū)分單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,進一步證實了選擇性平板分離培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)果的準確性。此方法省去了溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的鑒定步驟,使檢測效率提高的同時也提升了檢測的準確度。

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