石仙桃多糖對肺炎支原體感染模型小鼠Th1/Th2細胞因子表達的影響

黃梅青 朱燕華 趙世元

[摘要] 目的 探討石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎模型小鼠的肺泡灌洗液（BALF）中γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-12等細胞因子表達的影響。 方法 采用配對設計隨機方法將90只BABL/C裸鼠分為三組：模型組、克拉霉素組和石仙桃多糖組，每組30只。用PPLO肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)肺炎支原體，將成功培養(yǎng)的肺炎支原體滴入裸鼠鼻腔1×107 CCU/mL菌液各50 μL（1、5、8 d）。造模第9天開始，石仙桃多糖組用石仙桃多糖干預，克拉霉素組按15 mg/kg劑量灌胃給藥，連續(xù)6 d，模型組灌胃等體積的生理鹽水。干預1、3、6 d后，分別收集小鼠BALF，用SP4瓊脂平板定量培養(yǎng)BALF肺炎支原體，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等細胞因子水平，肺部組織用中性甲醛固定HE染色，觀察肺炎支原體感染小鼠肺的病變程度。 結果 與模型組比較，石仙桃多糖組BALF定量培養(yǎng)肺炎支原體菌落數(shù)量明顯減少（P < 0.05），肺部炎癥明顯好轉，肺組織病理學評分和肺實質炎癥評分明顯下降（P < 0.05或P < 0.01）。治療第1、3、6天，石仙桃多糖組IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 石仙桃多糖顯著減輕肺炎支原體肺炎小鼠肺部炎癥，其機制可能與降低肺炎支原體肺炎模型小鼠體內Th1/Th2細胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α的表達有關。

[關鍵詞] 石仙桃；多糖；肺炎支原體；細胞因子；Th1/Th2

[中圖分類號] R766.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0015-05

Effect of polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. on the expression of Th1/Th2 cytokines in mice infected with Mycoplasma pneumoniae

HUANG Meiqing1 ZHU Yanhua2 ZHAO Shiyuan2

1.Department of Pediatrics， Chongzuo People's Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 2.Department of Pharmacy， the Affiliated National Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. on the expression of γ- interferon （IFN-γ）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-1β， IL-12 and other cytokines in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of model mice of Mycoplasma pneumoniae pneumonia. Methods By matched pair design random method， ninety BALB/c nude mice were randomly divided into three groups： model group， Clarithromycin group and polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group， with 30 mice in each group. PPLO broth medium was used to cultivate mycoplasma pneumonia， the successfully cultivated Mycoplasma pneumoniae was dropped into the nasal cavity of nude mice 1×107 CCU/mL bacteria solution， each 50 μL （1， 5， 8 d）. From the ninth day of modeling， polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group was started to be use polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl.， Clarithromycin group was given 15 mg/kg of Clarithromycin by intragastric administration， continued for 6 d， the model group was given same volume of normal saline by gavage. After intervention for 1， 3， 6 d， the mice BALF was collected， SP4 agar plate was used to cultivate BALF Mycoplasma pneumoniae quantificationally， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α. Lung tissue was fixed with neutral formalin to take HE staining. The pathological degree of mice infected by Mycoplasma pneumoniae was observed. Results Compared with model group， the number of bacterial colonies of Mycoplasma pneumoniae cultivated by BALF quantificationally in polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group was reduced significantly （P < 0.05）， the pulmonary inflammation was improved significantly， and the scores of lung pathology and pulmonary parenchyma were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. After treatment for 1， 3， 6 d， the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group were significantly lower than those of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. can significantly reduce the pulmonary inflammation of mice with Mycoplasma pneumoniae pneumonia， the mechanism may be related to reduce the expression of Th1/Th2 cytokines of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in model mice with Mycoplasma pneumoniae pneumonia.

[Key words] Pholidota chinensis Lindl.； Polysaccharide； Mycoplasma pneumoniae； Cytokine； Th1/Th2石仙桃來源于蘭科石仙桃屬植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.的假鱗莖或全草，廣泛分布于福建、廣東、廣西等省，其水提物具有養(yǎng)陰、清肺、利濕、消瘀的功效，民間用來治療眩暈、頭痛、咳嗽、吐血、夢遺、痢疾等[1]。石仙桃主要成分是多糖[2]，其藥理作用研究較少。本研究采用石仙桃提取的石仙桃多糖通過建立肺炎支原體肺炎模型BALB/c小鼠，觀察肺炎支原體菌落數(shù)量、肺組織病理學評分、肺實質炎癥評分和肺泡灌洗液（BALF）中γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-12等的表達，探討石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎小鼠可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

90只BALB/c小鼠，SPF級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）2016-009。BALB/c小鼠5周齡，（20±2）g，雌雄各半，大鼠飼養(yǎng)條件：室溫20～25℃，用干燥鋸末墊底，室內通風良好，光線良好充足。大鼠在廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗用藥

石仙桃鱗徑采自廣西區(qū)境內，經廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃，石仙桃鱗莖洗凈后切細，干燥后打粉。石仙桃粉加1∶40蒸餾水80℃回流5 h，待冷卻后用無水乙醇沉淀，沉淀物用丙酮和乙醚萃取數(shù)次，得粗多糖。粗多糖用Sevag法脫除蛋白質，用95%乙醇沉淀，再將沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脫水，重復操作數(shù)次，得石仙桃多糖[2]。經高效色譜，有一對稱單峰，并在260～280 nm無吸收峰，說明多糖含量較高。樣品真空包裝、冰箱冷藏保存在廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院中心實驗室。

1.3 主要儀器和試劑

UV紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司，型號：1100型）；紅外光譜儀（德國Bruker公司，型號：IR EQUINOX 55）；超導核磁共振譜儀（英國VG公司，型號：ESCALABMK-11型）；熔點測定儀（北京科儀電光儀器廠，型號XPR-201）；離心機（常州市凱航儀器有限公司，型號：YXJ-2）；酶標儀（上?？迫A生產，型號：MK3）。

柱層析用硅膠（100～200目）、薄層層析硅膠（200～300目）均由青島海洋化工生產（批號：14089、141020）。PPLO肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物技術有限公司，肺炎支原體菌液購于上海寶米科生物科技有限公司?？死顾胤稚⑵ń髦扑幱邢挢熑喂旧a，批號：20150319）。細胞因子試劑盒IL-1β（批號：20160608）、IL-12（批號：20160628）、IFN-γ（批號：20160518）、TNF-α（批號：20160512）購于BioSource International，Camarillo，CA。

1.4 實驗方法

1.4.1 肺炎支原體的培養(yǎng) 肺炎支原體培養(yǎng)在每瓶20 mL的SP4肉湯中，經37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，肉湯變成橙色，倒出上清液，加新鮮的SP4肉湯2 mL，收集貼壁存活肺炎支原體。將肺炎支原體配成108～109 CFU/mL，加制霉菌素（50 U/mL）和氨芐青霉素（1 mg/mL），樣本保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 動物模型的建立 實驗方案由廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查，所有的動物按照實驗動物的護理和使用指南處理。新購BALB/c小鼠適應新環(huán)境3 d。采用配對設計隨機方法將90只BALB/c小鼠分為模型組、克拉霉素組和石仙桃多糖組，每組30只。各組小鼠第1天滴鼻接種含1×107 CCU/mL肺炎支原體菌液50 μL（將小鼠頭后仰滴加菌液，使菌液流入呼吸道），第5、8天接種含1×107 CCU/mL肺炎支原體菌液各100 μL。造模成功標準：造摸第9天小鼠血液分離培養(yǎng)和PCR檢測肺炎支原體，確認肺炎支原體模型的建立[3]。石仙桃多糖組小鼠于第9天起首次灌胃石仙桃多糖30 mg/kg（0.2 g溶于5%葡萄糖注射液0.1 mL，即0.05 mL/g），以后每天按15 mg/kg灌胃，連續(xù)6 d。克拉霉素組造摸第9天起按15 mg/kg克拉霉素劑量灌胃給藥，連續(xù)6 d。模型組同期灌胃給予等體積生理鹽水。用藥期間每天觀察各組小鼠表現(xiàn)，如小鼠存活、進食、飲水、活動度、精神狀態(tài)差，有無豎毛寒戰(zhàn)、咳嗽，口鼻分泌物有無增多。在用藥1、3、6 d后，各組分別取10只小鼠，用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，用25號針頭將500 μL SP4肉湯注入肺部，隨后又將該液抽吸到注射器，BALF分3管，第1管做肺炎支原體培養(yǎng)，第2管做細胞計數(shù)，第3管離心吸上清并儲存在-80℃；肺標本用10%福爾馬林溶液固定進行組織學評價。

1.5 觀察指標

1.5.1 BAL肺炎支原體培養(yǎng) 將BAL用SP4肉湯稀釋10倍稀釋，接種在SP4瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)48 h。通過計數(shù)瓊脂板上的菌落數(shù)量推算BAL標本細菌數(shù)量（用log10 CFU/mL表示）。

1.5.2 肺組織病理學評分和肺實質炎癥評分 肺組織經10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，經蘇木精-伊紅染色。肺組織病理學評分由專業(yè)病理醫(yī)師雙盲鏡檢。肺組織病理學評分分級基于細支氣管支氣管浸潤數(shù)目、細支氣管支氣管管腔滲出程度、血管周圍浸潤百分率和實質性肺炎嚴重程度（中性粒細胞肺泡浸潤），該系統(tǒng)評分分值為0～26分，分數(shù)越高代表肺組織炎性浸潤程度越高。肺實質炎癥評分是基于分級的中性粒細胞肺泡浸潤（0分，沒有實質性肺炎；3分，片狀實質性肺炎；5分，片狀融合實質性肺炎）[4]。

1.5.3 各組小鼠BALF中Th1/Th2細胞因子的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等細胞因子的水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎小鼠BALF肺炎支原體培養(yǎng)結果的影響

各組小鼠BALF定量培養(yǎng)肺炎支原體，結果顯示，與模型組比較，石仙桃多糖組及克拉霉素組小鼠治療1、3、6 d后，BAL標本細菌數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎小鼠肺組織病理和肺實質炎癥的影響

治療3 d后，與模型組比較，石仙桃多糖組及克拉霉素組肺組織病理學評分和肺實質炎癥評分均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。治療6 d后，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)重度炎癥改變：肺泡出現(xiàn)大量的滲出物，肺泡間質增寬，在支氣管和血管周圍以及肺泡間質有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤；克拉霉素組炎癥細胞明顯減少；石仙桃多糖組小鼠肺組織中炎癥細胞也明顯減少，可見肺泡間質稍增寬，在支氣管、血管周圍有少量淋巴細胞和巨噬細胞。見圖2～4。

2.3 石仙桃多糖不同干預時間對肺炎支原體肺炎小鼠BALF中Th1/Th2細胞因子表達的影響

治療第1天，石仙桃多糖組肺炎支原體肺炎小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ水平明顯下調，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。治療第3天，石仙桃多糖組肺炎支原體肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ水平明顯下調，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。治療第6天，石仙桃多糖組肺炎支原體肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、TNF-α水平明顯下調，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

石仙桃屬是蘭科植物，別名石橄欖、石上仙桃和石上蓮等。石仙桃性甘、淡、涼，具有清熱潤燥、化疾止咳、滋陰解毒、涼血止痛等功效，民間用于肺熱咳嗽、肺結核咳血、淋巴結結核、小兒疳積、胃十二指腸潰瘍、慢性骨髓炎等。用石仙桃的鮮品或干品煎湯內服，可治肺結核咳血、慢性咳嗽、胃腸炎、慢性胃炎、小便不利、濕熱浮腫、咽喉腫痛[5-6]。石仙桃的主要成分是多糖，含量高達2.25%[7]。研究表明，多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、降糖等作用[8]。但迄今為止，有關石仙桃多糖的藥理作用研究國內外均鮮見報道。本研究采用廣西柳州柳江區(qū)石仙桃提取的石仙桃多糖，通過建立肺炎支原體肺炎模型BALB/c小鼠，探討石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎小鼠可能的作用機制。

本研究采用石仙桃多糖干預肺炎支原體肺炎模型小鼠，定量培養(yǎng)小鼠BALF肺炎支原體，結果發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體有減少的趨勢，但與模型組比較沒有顯著差異（P > 0.05），石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎定量微生物培養(yǎng)結果的影響與石仙桃多糖改善肺部炎癥不相關，其可能通過抑制微生物蛋白合成，影響體內肺炎支原體復制頻率，從而改變宿主免疫系統(tǒng)的激活。

研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體肺炎在發(fā)病免疫學中起重要作用，其中T細胞既有免疫保護又有免疫致病的雙重作用[9-11]。機體在抵抗病原體、預防肺炎支原體肺炎肺外并發(fā)癥、加速機體恢復中依賴T細胞的激活。研究發(fā)現(xiàn)，SCID小鼠和普通小鼠感染相同數(shù)量的肺炎支原體，普通小鼠肺部炎癥明顯加重，而SCID小鼠由于免疫T或B細胞，其肺部炎癥較輕，淋巴細胞在肺炎支原體肺炎肺部癥狀中起重要作用[12-15]。肺炎支原體肺炎的細胞免疫調節(jié)使Th1表達上調，造成了呼吸系統(tǒng)的免疫損傷[16-18]。根據細胞因子分為Th1和Th2兩大功能細胞亞群，Th1細胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β、IL-12細胞因子，主要參與細胞免疫反應，在機體清除病原微生物的過程中起重要作用。Th2細胞主要分泌IL-1β、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，主要參與體液免疫調節(jié)。人體健康情況下，Th1/Th2處于平衡狀態(tài)。若Th1/Th2失衡，可以使免疫功能發(fā)生紊亂，在其他誘因的協(xié)同下可致免疫性疾病[19]。

肺炎支原體肺炎機體Th1/Th2值下降，Th2細胞占優(yōu)勢，機體存在免疫失調[20]。本研究通過觀察肺炎支原體肺炎小鼠BALF不同時間細胞因子的表達，結果顯示，治療第1天，石仙桃多糖組肺炎支原體肺炎小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ水平明顯下調，治療第3天，石仙桃多糖組肺炎支原體肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ水平明顯下調。IL-12在Th1型細胞因子中較為重要，它能調節(jié)Th1/Th2平衡，IL-12表達下調時，Th1反應低下，而Th2反應增強[13]；同時IL-12對Th2型細胞因子的產生具有抑制作用，可抑制Th2型應答反應，減輕氣道炎性反應。呼吸系統(tǒng)的免疫損傷迅速減輕。

綜上所述，石仙桃多糖干預肺炎支原體模型小鼠能迅速調節(jié)肺炎支原體肺炎小鼠體內的免疫功能，小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α等細胞因子明顯下調，輔助性Th1細胞因子明顯降低，小鼠肺部炎癥明顯減少，其作用機制可能與調節(jié)肺炎支原體模型小鼠體內Th1/Th2細胞有關。本研究結果為石仙桃多糖研發(fā)成為抗支原體藥物提供理論依據。

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（收稿日期：2017-11-25 本文編輯：張瑜杰）