吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量

吳 凡 任 春 文 華* 蔣 明 劉 偉 田 娟 楊長庚 喻麗娟 陸 星

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，魚類營養(yǎng)與飼料研究室，武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

吉富羅非魚(genetically improved farmed tilapia，GIFT，Oreochromisniloticus)是經(jīng)遺傳改良后的羅非魚，其生長速度快、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)力強(qiáng)，已成為我國重要的養(yǎng)殖品種。羅非魚對維生素B6的需要量國外已有部分報(bào)道，根據(jù)飼料蛋白質(zhì)水平的不同，奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)對飼料中維生素B6的需要量有所差異，分別為1.7～9.5 mg/kg(28%蛋白質(zhì)水平)和15.0～16.5 mg/kg(36%蛋白質(zhì)水平)[10]；紅羅非魚(Oreochromismossambicus×O.niloticus) 對飼料中維生素B6的需要量為3 mg/kg[11]。由于吉富羅非魚生長速度比其他品系快，而生長速度的不同會(huì)造成生理代謝的差異，對營養(yǎng)素的需要量也有差異，因此有必要評估吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量。本試驗(yàn)以吉富羅非魚為研究對象，考察飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚生長性能、全魚和肌肉營養(yǎng)組成及血清和肝臟生化指標(biāo)的影響，以確定吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以酪蛋白和明膠為蛋白質(zhì)源，以玉米油和豆油為脂肪源，以糊精為糖源，配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。維生素B6的設(shè)計(jì)水平分別為0(對照組)、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg/kg，共配制6種純化飼料。先將維生素B6與纖維素混合配制成一定濃度的維生素B6預(yù)混料，再根據(jù)設(shè)計(jì)水平向飼料中添加不同質(zhì)量的預(yù)混料，每組均以纖維素的增減來平衡維生素B6預(yù)混料的不同。飼料配制時(shí)先將干性飼料原料粉碎后過60目篩，按配制表準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量后逐級混勻，加玉米油和豆油混合均勻，再加適量水用制粒機(jī)加工成直徑2.0 mm條狀，電風(fēng)扇吹干后，破碎成長約4.0 mm圓柱形顆粒料，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆?。采用微生物?德國拜發(fā)公司生產(chǎn)的試劑盒)測得6種純化飼料中維生素B6含量分別為0.3、2.7、5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克維生素預(yù)混料包含 One kg of vitamin premix contained: VB15 g，VB210 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 10 g，生物素 biotin 0.6 g，葉酸 folic acid 1.5 g，肌醇 inositol 200 g，L-維生素C-2-磷酸鎂 magnesiumL-ascorbic acid-2-monophosphate 60 g，煙酸 niacin 6.05 g，α-維生素E醋酸酯 α-tocopheryl acetate 50 g，VA 2 000 000 IU，VK 4 g，VD3400 000 IU。

2)每千克礦物鹽預(yù)混料包含 One kg of mineral premix contained: Ca(H2PO4)2·H2O 135.8 g，Ca(CH3CHOHCOO)2·5H2O 327 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.125 g，MgSO4137 g，NaH2PO487.2 g，NaCl 43.5 g，AlCl3·6H2O 0.15 g，KIO30.125 g，KCl 75 g，CuCl2·2H2O 0.1 g，MnSO4·H2O 0.80 g，CoCl2·6H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 3 g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)魚由廣西羅非魚國家級育種試驗(yàn)場提供，運(yùn)回武漢市江夏區(qū)山坡鄉(xiāng)養(yǎng)殖基地網(wǎng)箱中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間投喂未添加維生素B6的基礎(chǔ)飼料，2周后挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻、初始平均體質(zhì)量為(56.3±1.8) g的吉富羅非魚360尾，隨機(jī)分成6個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚。各重復(fù)隨機(jī)分配于18個(gè)網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.5 m)中，每個(gè)網(wǎng)箱20尾魚。各組分別飼喂維生素B6含量分別為0.3(對照組)、2.7、5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg的6種純化飼料，進(jìn)行10周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。

每天投喂2次(09:00、16:00)，表觀飽食投喂，每2周稱重1次，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)10周。每日觀察記錄水溫、試驗(yàn)魚攝食及死亡情況。養(yǎng)殖期間的水溫為27～33 ℃，pH為7.2～7.5，溶解氧濃度>5.0 mg/L，總氨氮濃度<0.05 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖10周后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h后稱取每個(gè)網(wǎng)箱的試驗(yàn)魚總重并記錄尾數(shù)。從每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取3尾魚，測量其體長、體重，從尾靜脈采血后進(jìn)行解剖，迅速分離內(nèi)臟和肝臟，并稱其重量，計(jì)算臟體比和肝體比；保存肝臟樣品，用于肝臟生化指標(biāo)測定；解剖并保存肌肉樣品，用于營養(yǎng)組成的測定。將裝有血液的離心管靜置于4 ℃冰箱中2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，用于部分血清生化指標(biāo)的檢測。每個(gè)網(wǎng)箱另外取3尾魚用于全魚營養(yǎng)組成的測定。肝臟、肌肉、血清和全魚樣品置-40 ℃冰箱中保存待測。

1.4 測定方法

1.4.1 生長性能

生長性能指標(biāo)的計(jì)算公式如下:

成活率(SR，%)=100×Nt/N0；增重率(WGR，%)=100×(Mt-M0)/M0；飼料系數(shù)(FCR)=Wf/(Wt-W0)；臟體比(VSI，%)=100×Mv/Mw；肝體比(HSI，%)=100×Mh/Mw；肥滿度(CF，%)=100×Mw/L3。

式中：N0和Nt分別為試驗(yàn)魚的初始尾數(shù)和終末尾數(shù)；M0和Mt分別為試驗(yàn)魚的初始均重和終末均重(g)；Wf為攝食飼料總量(g)；W0和Wt分別為試驗(yàn)魚的初始總重和終末總重(g)；Mv為樣品魚內(nèi)臟重(g)；Mh為樣品魚肝臟重(g)；Mw和L分別為樣品魚體重(g)和體長(cm)。

1.4.2 全魚和肌肉營養(yǎng)組成

全魚和肌肉的營養(yǎng)組成分析采用AOAC(2000)[12]的方法。水分含量的測定采用105 ℃恒溫干燥失重法，粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法，粗灰分含量的測定采用馬福爐灰分法。

1.4.3 血清和肝臟生化指標(biāo)

稱取1 g肝臟樣本(精確到0.01 g)，按照重量(g)加入9倍體積(mL)的生理鹽水，置于冰上機(jī)械勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于肝臟生化指標(biāo)的檢測。血清堿性磷酸酶(ALP)活性，葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)和尿素氮(UN)含量，肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性采用Sysmex Chemix-800全自動(dòng)生化分析儀測定。另用南京建成生物工程研究所的考馬斯亮藍(lán)試劑盒檢測肝臟勻漿液的蛋白濃度。肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性計(jì)算方法如下：

肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(U/g prot)=
生化分析儀檢測的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶
活性(U/L)/肝臟勻漿液蛋白濃度(g/L prot)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著水平為P<0.05。利用折線(broken-line)回歸分析得出吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量[13]。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚生長性能的影響

由表2可知，隨著飼料中維生素B6含量的增加，吉富羅非魚的增重率呈現(xiàn)先顯著增加(P<0.05)后趨于穩(wěn)定的趨勢，2.7、5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg組均顯著高于對照組(P<0.05)；10.1、20.5和39.8 mg/kg組顯著高于其他各組(P<0.05)，但這3組之間并無顯著差異(P>0.05)。吉富羅非魚的飼料系數(shù)呈下降趨勢，5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg組顯著低于對照組和2.7 mg/kg組(P<0.05)。5.4、20.5 mg/kg組吉富羅非魚的肝體比顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。0.3、2.7、5.4、10.1、20.5 mg/kg組之間吉富羅非魚的肥滿度無顯著差異(P>0.05)；39.8 mg/kg組肥滿度最高，顯著高于2.7和5.4 mg/kg組(P<0.05)。各組之間吉富羅非魚的臟體比無顯著差異(P>0.05)。

由圖1可見，通過折線回歸分析得知，吉富羅非魚獲得最大增重率時(shí)，對飼料中維生素B6的需要量為9.22 mg/kg。

表2 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

圖1 吉富羅非魚增重率與飼料中維生素B6

2.2 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚全魚和肌肉營養(yǎng)組成的影響

由表3可知，2.7、5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg組全魚粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量顯著高于對照組(P<0.05)，而2.7、5.4、10.1、20.5和39.8 mg/kg組之間無顯著差異(P>0.05)。2.7 mg/kg組的全魚水分含量最低，顯著低于對照組和10.1、20.5 mg/kg組(P<0.05)。全魚的粗脂肪含量以10.1 mg/kg組最低，顯著低于除了20.5 mg/kg組以外的其余各組(P<0.05)。各組肌肉的水分和粗脂肪含量無顯著差異(P>0.05)，但5.4、10.1和20.5 mg/kg組的肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 飼料維生素B6含量對吉富羅非全魚和肌肉營養(yǎng)組成的影響

2.3 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚血清和肝臟生化指標(biāo)的影響

由表4可知，隨著飼料中維生素B6含量的增加，血清堿性磷酸酶活性和尿素氮含量呈上升趨勢，其中，20.5和39.8 mg/kg組血清堿性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，這2組之間無顯著差異(P>0.05)；10.1、39.8 mg/kg組血清尿素氮含量顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。各組之間血清總蛋白、葡萄糖含量無顯著差異(P>0.05)。各組之間肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著差異(P>0.05)。10.1、20.5和39.8 mg/kg組肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對照組和2.7、5.4 mg/kg組(P<0.05)，5.4 mg/kg組顯著高于對照組和2.7 mg/kg組(P<0.05)。

由圖2可見，以肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，通過折線回歸分析得到吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量為10.11 mg/kg。

表4 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚血清和肝臟生化指標(biāo)的影響

圖2 吉富羅非魚肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與飼料中

3 討 論

3.1 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚生長性能的影響

維生素B6在動(dòng)物體內(nèi)以輔酶或輔基的形式參與神經(jīng)遞質(zhì)、糖原、血紅素等的合成與代謝反應(yīng)，且主要參與和氨基酸代謝相關(guān)的反應(yīng)，因此缺乏維生素B6時(shí)會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物的正常生長及其體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，最終出現(xiàn)缺乏癥。異育銀鯽缺乏維生素B6會(huì)出現(xiàn)厭食、萎靡不振、狂游以及死亡率增高等癥狀[8]。點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)缺乏維生素B6則出現(xiàn)食欲不振、存活率低、驚厥、螺旋狀游泳等缺乏癥[14]。奧尼羅非魚攝食缺乏維生素B6的飼料3周后出現(xiàn)厭食和運(yùn)動(dòng)失調(diào)的癥狀，死亡率上升，并且死亡的魚出現(xiàn)水腫[10]。本試驗(yàn)對照組的魚除了生長緩慢以外，未觀察到其他明顯的缺乏癥。這可能是因?yàn)樵囼?yàn)魚初始體重為50 g左右，在其生長的前期階段體內(nèi)已積累了一定量的維生素B6，因此在養(yǎng)殖周期內(nèi)未出現(xiàn)在幼魚階段易觀察到的缺乏癥；另外一個(gè)原因是養(yǎng)殖試驗(yàn)主要在網(wǎng)箱中進(jìn)行，水環(huán)境中的微生物可能利于吉富羅非魚合成部分維生素B6。吉富羅非魚的增重率隨著飼料中維生素B6含量的增加而升高，直到10.1 mg/kg后趨于穩(wěn)定，說明維生素B6對吉富羅非魚的生長是必需的，這種變化趨勢在奧尼羅非魚[10]和草蝦(Penaeusmonodon)[15]中也觀察到，說明維生素B6在一定范圍內(nèi)可以滿足養(yǎng)殖動(dòng)物的生長，但過量時(shí)并未用于生長，可能用于其他生理活動(dòng)。

臟體比、肝體比和肥滿度反映了機(jī)體的營養(yǎng)狀況。異育銀鯽攝食未添加維生素B6的飼料后，肝體比顯著低于其他維生素B6添加組[8]。本試驗(yàn)中，隨著飼料中維生素B6含量的升高，肝體比呈上升趨勢，肥滿度也在39.8 mg/kg組達(dá)到最高。雖然對照組的吉富羅非魚未出現(xiàn)其他肉眼可見的缺乏癥，但肝體比的降低說明維生素B6不足可能造成了營養(yǎng)不良，對吉富羅非魚的生理造成了不良影響。

3.2 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚全魚和肌肉營養(yǎng)組成的影響

本試驗(yàn)中維生素B6添加組的全魚粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組，肌肉粗蛋白質(zhì)含量也呈升高趨勢，說明維生素B6促進(jìn)了蛋白質(zhì)的利用與合成。以往研究表明，攝食添加維生素B6飼料的異育銀鯽蛋白質(zhì)含量高于對照組[8]，對紅羅非魚的研究也有相似結(jié)果[11]。維生素B6的輔酶形式包括磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺，作為輔酶參與氨基酸代謝反應(yīng)，包括轉(zhuǎn)氨作用、去氨作用和脫硫作用，對氨基酸的吸收與合成是必需的，有利于機(jī)體蛋白質(zhì)的合成[16]。維生素B6作為輔酶還參與不飽和脂肪酸的代謝。大鼠缺乏維生素B6時(shí)，肝臟微粒體△6去飽和酶活性降低，必需脂肪酸代謝受阻，代謝起始物蓄積會(huì)增多[17]。本試驗(yàn)中，飼料中10.1 mg/kg的維生素B6可以降低羅非魚全魚粗脂肪含量，這與對烏醴(Channaargus)的研究結(jié)果[18]一致。在草魚(Ctenopharyngodonidella)研究中也發(fā)現(xiàn)維生素B6有助于脂肪的代謝，避免在體組織沉積[19]。

3.3 飼料中維生素B6含量對吉富羅非魚血清和肝臟生化指標(biāo)的影響

轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，參與氨基酸的分解和合成，在機(jī)體的生長代謝中發(fā)揮重要作用，尤以谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶更為重要。維生素B6是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，同時(shí)也與蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)，因此會(huì)影響轉(zhuǎn)氨酶的活性。例如，維生素B6能顯著提高皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)內(nèi)臟團(tuán)和肌肉中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性[20]；草蝦肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性隨著飼料維生素B6含量的升高呈先升高后下降的趨勢[15]。本研究中，隨著飼料中維生素B6含量的升高，肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著上升，在維生素B6含量達(dá)到10.1 mg/kg后趨于穩(wěn)定。肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈上升趨勢未出現(xiàn)顯著差異，血清總蛋白含量也有相同趨勢。維生素B6雖能影響轉(zhuǎn)氨酶的活性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，但可能由于本試驗(yàn)的養(yǎng)殖周期不夠長，因此各組間未出現(xiàn)顯著差異；也可能氨基酸代謝增強(qiáng)后，通過血液循環(huán)進(jìn)入到組織中的氨基酸含量增多，主要影響全魚和肌肉蛋白質(zhì)含量，因而血清總蛋白含量并未顯著上升。

血清尿素氮是非蛋白質(zhì)類含氮物，反映了魚體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝狀況。本試驗(yàn)中隨著飼料中維生素B6含量的升高，羅非魚血清尿素氮含量上升，說明維生素B6影響了魚體的蛋白質(zhì)代謝。但也有研究認(rèn)為尿素氮含量增加表明蛋白質(zhì)代謝負(fù)擔(dān)加重[21]，這也提示飼料中維生素B6含量并非越高越好，含量過高可能會(huì)加重魚體的代謝負(fù)擔(dān)。關(guān)于維生素B6對堿性磷酸酶活性影響的相關(guān)報(bào)道比較少，本試驗(yàn)中，血清堿性磷酸酶升高應(yīng)該主要還是受蛋白質(zhì)代謝的影響。堿性磷酸酶是一種磷酸單脂酶，是生物體內(nèi)與蛋白質(zhì)有關(guān)的代謝調(diào)控酶，同時(shí)也是溶酶體標(biāo)志性酶，可以評價(jià)動(dòng)物的免疫功能。血清堿性磷酸酶活性的升高提示著維生素B6可能增強(qiáng)了魚體的免疫功能，但要結(jié)合其他免疫指標(biāo)才能客觀評價(jià)，這還需要進(jìn)一步研究。

3.4 吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量

Cowey[24]認(rèn)為評價(jià)養(yǎng)殖魚類營養(yǎng)素的需要量可以參考一些生化指標(biāo)，如某些特定的酶活性。由于許多維生素自身或者以改良的形式作為輔酶發(fā)揮生理功能，測定一些組織的酶活性通常被用于補(bǔ)充評價(jià)養(yǎng)殖動(dòng)物對維生素的需要量。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，參與氨基酸的分解和合成，并且需要磷酸吡哆醛作為輔酶，因此肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性常被用來評價(jià)魚類體內(nèi)維生素B6狀態(tài)。本試驗(yàn)中以肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量為10.11 mg/kg，這要略高于以增重率為評價(jià)指標(biāo)得出的9.22 mg/kg。在對奧尼羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)，在飼料蛋白質(zhì)水平為28%時(shí)，以生長為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，初始體重為(0.73±0.01) g的奧尼羅非魚幼魚對飼料中維生素B6需要量為1.7 mg/kg；以肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，對飼料中維生素B6的需要量為9.5 mg/kg；而當(dāng)飼料蛋白質(zhì)水平為36%時(shí)，這2個(gè)需要量結(jié)果分別為16.5和15.0 mg/kg[10]。這主要是由于維生素B6與氨基酸代謝密切相關(guān)，所以飼料蛋白質(zhì)含量會(huì)影響維生素B6的需要量。關(guān)于不同品系羅非魚對維生素B6需要量是否存在差異，應(yīng)該在相同試驗(yàn)條件下，選取初始體重相當(dāng)?shù)聂~，并投喂相同飼料，然后進(jìn)行比較分析。

4 結(jié) 論

綜合以上結(jié)果，以增重率和肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為評價(jià)指標(biāo)，通過折線回歸分析得到初始體重為(56.3±1.8) g的吉富羅非魚對飼料中維生素B6的需要量分別為9.22和10.11 mg/kg。

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