小反芻動物慢病毒通用PCR檢測方法的建立與初步評價

楊義琴 ，吳建勇 ，古努爾·吐爾遜 ，李建軍 ，楊學云 ，賈 斌 ，王登峰 *

（1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心），新疆 烏魯木齊 830000）

小反芻動物慢病毒 （Small Ruminant Lentiviruses，SRLV）是梅迪-維斯納病毒 （Maedi visna virus，MVV）和山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV）兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的統(tǒng)稱；基于病毒pol-gag基因序列的進化分析將其分為A、B、C、D和E五個亞群[1,2]。病毒感染后可通過前病毒DNA形式將遺傳物質(zhì)整合到宿主單核細胞和巨噬細胞中，使宿主持續(xù)感染，并通過初乳、常乳和呼吸道分泌物持續(xù)或間接性排毒而擴大感染[3,4]。兩種病毒感染具有一定的宿主特異性，即CAEV多感染山羊，而MVV傾向于感染綿羊；然而近年來的分子流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病毒可跨種感染家養(yǎng)和野生山羊亞科和綿羊亞科動物，并在實驗室也獲得了交叉感染的相關(guān)證據(jù)[2,5,6]，因而建立通用的CAEV、MVV核酸檢測方法極為必要。

目前，研究報道了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、DNA印跡法、原位雜交或PCR克隆測序、RT-PCR等[7,8]等方法以檢測、定量和鑒定MVV和CAE前病毒DNA，用于補充血清學試驗無法確定的可疑感染[9,10]，但由于小反芻動物慢病毒具有多個不同亞群，已建立的PCR擴增方法僅能檢測其中某一亞群病毒，多用于某個國家或地區(qū)特定的MVV和CAEV的檢測[7,10]，并且課題組前期研究中證實了我國SRLVs主要為A2、B1亞群（未發(fā)表），因此亟待建立適用于我國SRLVs早期檢測的技術(shù)方法。

本研究在比對分析已公開的CAEV和MVV基因組序列基礎(chǔ)上，篩選vif基因中約150 bp序列作為診斷標識物，設(shè)計簡并引物，建立PCR擴增方法，通過對實驗室保存CAEV和MVV病毒RNA和前病毒DNA檢測，初步證實該方法具有一定的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒（CAEV）參考株（ATCC VR-905）購自美國菌種保藏中心（ATCC），山東分離株（KT749878.1）、貴州株（Guizhou，KT749880.1）和梅迪-維斯納病毒（MVV40）由本實驗室保存。 CAEV 和MVV分別接種山羊關(guān)節(jié)滑膜細胞和綿羊的脈絡(luò)叢細胞持續(xù)培養(yǎng)14 d，收取培養(yǎng)上清，4℃，8000×g離心10 min，提取上清RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為待測模板；提取細胞培養(yǎng)物前病毒DNA作為待測模板。

1.2 試劑

中量血液基因組DNA提取試劑盒（0.5-3 mL）（DP332)、病毒RNA提取試劑盒(DP315-R)、2×Taq PCR Mastermix（KT201-02）、D2000 DNA Marker(MD114）、QuantScript RT Kit（KR103）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

登陸GenBank獲取所有CAEV和MVV的前病毒基因組（截止2017年5月30日），獲取24株CAEV前 病 毒 基 因 組 M34092.1、M34093.1、EU293537.2、M33677.1、NC 001463.1、GU120138.1、AY900630.1、KT749881.1、KT214469.1、KT749879.1、KT749880.1、KT749878.1、KT898826.1、HM210570.1、GQ381130.1、FJ195346.1、JF502416.1、JF502417.1、AF322109.1、KY358787.1、KY358788.1、KT453990.1、KT453989.1 和KT453988.1；MVV 的 前 病 毒 基 因 組 7 個 ， 獲 取 號 為 :HQ848062.1、NC001452.1、L06906.1、M10608.1、M51543.1、M60610.1和AF479638.1，使用ClustalX 2.1進行全基因組比對，篩選可設(shè)計引物的片段約200 bp，設(shè)計簡并引物P1和P2；同時，根據(jù)Giovanni.B報道[8]合成擴增CAEV的引物CAEV-R-1和CAEV-F-1，引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 小反芻動物慢病毒擴增引物信息

1.4 靶序列的合成與制備

選擇MVV前病毒基因組L06906.1和AF479638.1，CAEV前病毒基因組KT453988.1、KT749878.1和KY358787.15138-5233區(qū)序列作為模板序列，交由上海生工進行全基因合成，將合成的靶序列從質(zhì)粒上經(jīng)酶切、膠回收、核酸定量后作為測試模板。

1.5 PCR擴增與電泳

擴增反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系:其中2×Taq Mastermix 12.5μL，引物終濃度P1為1.2 mM，P2為2.0 mM，DNA模板2 μL，補ddH2O至25 μL。 PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，之后94℃變性30 s，50℃ 30 s，72℃30 s，共35循環(huán)；終末延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結(jié)果

2.1 簡并引物的設(shè)計和靶序列的比對

使用ClustalX 2.1對24株CAEV和7株MVV全基因組進行比對并繪制進化樹（圖1），在vif基因上篩選出可設(shè)計引物的序列，設(shè)計簡并引物P1和P2，將150 bp的靶序列作為診斷標識序列（圖2）；同時，選取具有代表性差異的MVV前病毒基因組L06906.1、AF479638.1和CAEV前病毒基因組KT453988.1、KT749878.1和KY358787.1的PCR靶序列進行基因合成作為擴增模板，其該段序列差異見圖2和圖3，選定毒株在進化樹上的分析見圖1。

圖1 小反芻動物慢病毒全基因組序列的比對分析

圖2 小反芻動物慢病毒全基因組中vif基因上可設(shè)計引物的序列

圖3 小反芻動物慢病毒PCR擴增中陽性對照序列的比對

2.2 PCR檢測方法的建立

使用設(shè)計的簡并引物P1和P2，以合成序列為模板，按照設(shè)定的擴增體系和條件進行擴增，擴增出與預(yù)期目的條帶 （圖4）；并用不同濃度模板 （C001-C005）檢測該方法的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對AF479638.1_C002模板的敏感性為0.0032 μM，對L06906.1_C001和KT453988.1_C003模板的敏感性為0.08 μM，對 KT749878.1_C004和KY358787.1_C005模板的敏感性為 0.4 μM（表 2），說明該方法具有較好的敏感性。

圖4 合成的序列為模板進行PCR擴增

表2 小反芻動物慢病毒PCR擴增方法對合成模板的敏感性測試

2.3 PCR擴增方法的驗證

使用 CAEV參考毒株（ATCC VR-905）、山東分離株（KT749878.1）和貴州株（KT749880.1）細胞培養(yǎng)病毒的cDNA和前病毒DNA為模板驗證建立的PCR擴增方法，結(jié)果顯示可以擴增出目標片段，使用山羊滑膜細胞基因組DNA為模板擴增為陰性，并使用已發(fā)表的CAEV-R-1和CAEV-F-1引物進行擴增驗證該結(jié)果，見圖5。

圖5 建立的PCR擴增方法對CAEV實驗室培養(yǎng)物的擴增

同時，以細胞培養(yǎng)的MVV病毒cDNA和前病毒DNA為模板使用建立的方法進行擴增，可以擴增出目標片段；而CAEV-R-1和CAEV-F-1引物對CAEV cDNA和前病毒DNA模板可以擴增目標條帶，擴增 MVV模板無結(jié)果（圖6）。

圖6 建立的PCR擴增方法對MVV實驗室培養(yǎng)物的擴增

3 討 論

小反芻動物慢病毒病呈現(xiàn)全球性分布，其中，MVV主要感染綿羊?qū)е逻M行性肺炎（OPP），CAEV感染山羊則主要表現(xiàn)為慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、滑囊炎和幼畜的腦炎等臨床癥狀，但受感染綿羊和山羊大多呈現(xiàn)隱性感染而無明顯臨床特征[3,4]，給養(yǎng)羊業(yè)帶來潛在的健康危害和經(jīng)濟損失，因此被我國農(nóng)業(yè)部列為二類動物疫病，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須通報的疫病，是國際綿羊和山羊進出口貿(mào)易必檢的動物疫病。我國在上世紀80年代末從進口吐根堡奶山羊和薩能奶山羊中發(fā)現(xiàn)并分離了該病毒[13]；但由于該病毒分離培養(yǎng)和批量抗原制備難度較大，近年來國內(nèi)有關(guān)小反芻動物慢病毒病的研究報道較少，獸醫(yī)臨床中也常忽視了該病毒的存在，因此國內(nèi)山羊和綿羊SRLVs的感染現(xiàn)狀和潛在危害尚不清楚，急需建立有效的檢測方法獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，以進一步完善我國當前SRLVs的檢疫與防控策略。

目前，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測方法有瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和PCR檢測方法，但由于潛伏感染期羊體內(nèi)的抗體水平較低[14]，AGID和ELISA并不適用感染后的早期診斷，當前國內(nèi)外多個實驗室建立了基于PCR擴增的病原學檢測方法，以檢測、定量和鑒定病毒RNA和前病毒DNA，根據(jù)基因組序列設(shè)計的引物進行特異性分析發(fā)現(xiàn)，當前所設(shè)計的引物可能僅適用于部分基因亞群毒株的檢測[11,12]，可能并不適用于開展大規(guī)?；騾^(qū)域性流行病學調(diào)查。本研究依據(jù)已公開CAEV和MVV前病毒基因組序列的比對結(jié)果，選取vif基因上約160 bp的序列設(shè)計簡并引物，并全基因合成代表性差異的3株CAEV和2株MVV靶序列作為模板，初步建立了可同時檢測MVV和CAEV DNA的PCR檢測方法，對合成模板的檢出極限為0.0032-0.40 μM。通過實驗室保存的3株CAEV和1株MVV細胞培養(yǎng)物RNA和前病毒DNA為模板初步驗證該方法可行。

由于本實驗室保存SLRVs毒株數(shù)量和來源有限，僅限于部分亞群（B1和A2）的檢測，因此尚需開展其它亞群毒株檢測效果評估和盲法驗證檢測方法的可靠性；進一步驗證其對臨床SLRVs的檢測效果，為我國新的SLRVs病原學檢測試劑盒的研發(fā)和大規(guī)模調(diào)查提供技術(shù)支撐。

參考文獻:

[1]Zanoni R G.Phylogenetic Analysis of Small Ruminant Lentiviruses[J].J Gen Virol,1998,79(8):1951～1961.

[2]Shah C,Boni J,Huder J B,et al.Phylogenetic Analysis and Reclassification of Caprine and Ovine Lentiviruses Based On 104 New Isolates:Evidence for Regular Sheep-To-Goat Transmission and Worldwide Propagation through Livestock Trade[J].Virology,2004,319(1):12～26.

[3]Adams D S,Klevjer-Anderson P,Carlson J L,et al.Transmission and Control of Caprine Arthritis-Encephalitis Virus[J].Am J Vet Res,1983,44(9):1670～1675.

[4]Crawford T B,Adams D S,Cheevers W P,et al.Chronic Arthritis in Goats Caused by a Retrovirus[J].Science,1980,207(4434):997～999.

[5]Karr B M,Chebloune Y,Leung K,et al.Genetic Characterization of Two Phenotypically Distinct North American Ovine Lentiviruses and their Possible Origin From Caprine Arthritis-Encephalitis Virus[J].Virology,1996,225(1):1～10.

[6]Shah C,Huder J B,Boni J,et al.Direct Evidence for Natural Transmission of Small-Ruminant Lentiviruses of Subtype A4 From Goats to Sheep and Vice Versa[J].J Virol,2004,78(14):7518～7522.

[7]Alvarez V,Daltabuit-Test M,Arranz J,et al.PCR Detection of Colostrum-Associated Maedi-Visna Virus(MVV)Infection and Relationship with ELISA-antibody Status in Lambs[J].Res Vet Sci,2006,80(2):226～234.

[8]Brajon G,Mandas D,Liciardi M,et al.Development and Field Testing of a Real-Time PCR Assay for Caprine Arthritis-Encephalitis-Virus(CAEV)[J].Open Virol J,2012,（6）:82～90.

[9]Santry L A,de Jong J,Gold A C,et al.Genetic Characterization of Small Ruminant Lentiviruses Circulating in Naturally Infected Sheep and Goats in Ontario,Canada[J].Virus Res,2013,175(1):30～44.

[10]de Andres D,Klein D,Watt N J,et al.Diagnostic Tests for Small Ruminant Lentiviruses[J].Vet Microbiol,2005,107(1-2):49～62.

[11]孫書華,蔣正軍,王治才,等.用聚合酶鏈反應(yīng)檢測山羊關(guān)節(jié)炎—腦炎及梅迪—維斯納病毒[J].中國動物檢疫,1996,(04):10～11.

[12]Zanoni R,Pauli U,Peterhans E.Detection of Caprine Arthritis-Encephalitis-and Maedi-Visna Viruses Using the Polymerase Chain Reaction[J].Experientia,1990,46(3):316～319.

[13]龔成潤,林杰,王冶才,等.我國山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎疫情調(diào)查[J].中國畜禽傳染病,1996，(03):51～55.

[14]Lacerenza D,Giammarioli M,Grego E,et al.Antibody Response in Sheep Experimentally Infected with Different Small Ruminant Lentivirus Genotypes[J].Vet Immunol Immunopathol,2006,112(3-4):264～271.