肽類探針在胃腸道腫瘤熒光分子成像中的應用

張 娜，劉海峰

目前，癌癥依然是人類健康的重大威脅之一。2018年最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示，雖然胃癌和結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率有所下降，但其在癌癥相關死亡原因中依然排在前列[1]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低胃腸道腫瘤發(fā)病率和病死率的主要措施。傳統(tǒng)的消化道腫瘤診斷模式是通過普通白光內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)可疑病變再進行隨機活檢，但由于早期消化道腫瘤缺乏典型的形態(tài)學改變，腫瘤病變分布不均一及活檢的局限性，很容易造成誤診和漏診[2]。因分子影像學可在細胞和分子水平上發(fā)現(xiàn)病變，實現(xiàn)疾病的早期診斷而得到迅速發(fā)展。光學分子成像屬于分子影像學的一個分支，相對于其他成像技術，其具有無輻射、低成本、可重復性高等優(yōu)點。高效的光學分子成像離不開良好的光敏劑，即熒光探針。目前，研究的熒光探針主要包括抗體、抗體片段、肽類、納米粒子、“智能”活化探針及核酸適體探針[3]。肽類探針因其固有的優(yōu)勢得到很大發(fā)展。雖然目前篩查肽種類很多，但應用于胃腸道腫瘤的靶向肽較少，故本文主要對用于胃腸道腫瘤熒光分子成像的肽類探針進行總結(jié)和分析。

1 肽類探針的篩選

自從1985年美國Missouri大學George P. Smith[4]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Escherichia coli（E.coli）絲狀噬菌體經(jīng)加工修飾后，可在某些噬菌體外殼蛋白的末端顯示外來氨基酸序列而不影響噬菌體感染活性及繁殖能力后，噬菌體展示技術在生物學領域得到了廣泛應用。該生物技術原理是將外源目的蛋白的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列插入到噬菌體外殼蛋白的基因中，外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，從而使外源蛋白表達于噬菌體表面。隨著噬菌體展示技術及相關組合化學的實現(xiàn)，基于肽類探針的分子成像得到迅速發(fā)展，成為促進腫瘤分子成像和診斷發(fā)展的經(jīng)濟、迅速、有效的方法[5]。

噬菌體展示文庫篩選技術通常是指通過體外培養(yǎng)的細胞，采用原位或在體方式利用靶分子在展示文庫中篩選帶有所需片段的噬菌體進行回收。利用該技術最終篩選出的噬菌體仍具有傳染性，并可通過感染新鮮的宿主細菌進行繁殖和克隆。外源肽的一級結(jié)構(gòu)可通過測序病毒DNA中的肽編碼序列進行確定。親和選擇過程通常需最少四輪以獲得與靶分子有效結(jié)合的噬菌體，其成功的關鍵取決于篩選過程的嚴格性。如果相對于結(jié)合所需靶標的稀有噬菌體具有優(yōu)越的生長優(yōu)勢，則會在整個選擇過程中繁殖不相關的噬菌體，導致在親和選擇程序中可能會損失最好的結(jié)合噬菌體。因此，嚴格的洗滌和噬菌體洗脫條件至關重要。用過量的游離靶標或配體競爭洗脫是洗脫特異性噬菌體的方法之一。在培養(yǎng)細胞，原位和體內(nèi)選擇中，靶標是未知的，因此只能使用非特異性洗脫程序。這些非特異性洗脫物由極端pH值、高離子強度、還原劑和洗滌劑組成，不足以破壞噬菌體與靶標之間的相互作用。此外，有研究表明，超聲也可在體外改善噬菌體從靶標的洗脫[6]。另一個改善親和選擇成功的方法是在整個實驗中控制好洗滌條件。對于體外篩選，目前已有嚴格和可控的洗滌條件，包括在大孔凝膠上的選擇和洗滌或色譜淘選[7]。Liu等[8]開發(fā)了一種微流體裝置，包括制造的鐵磁結(jié)構(gòu)，以允許捕獲和釋放磁珠，這有助于利用高流體力來控制清洗?？傊M一步完善篩選過程的質(zhì)控可有利于肽類探針的發(fā)展。

2 肽類探針實驗與臨床相關研究

肽是一種可與病變組織特異性結(jié)合的氨基酸片段，用熒光基團標記后可用于熒光成像。各類探針的優(yōu)缺點比較見表1。相對抗體來說，肽類探針具有分子量小、免疫原性小、高親和力、高選擇性、易化學修飾和良好的藥物動力學性能等特點[9,10]。相對于納米類探針來說，肽類探針合成過程簡單且具有更高的生物安全性，這些優(yōu)勢均有利于推動肽類熒光探針在臨床的應用。

2.1胃腫瘤及癌前病變 目前，關于胃癌的特異性靶點較少，因此用于胃癌熒光分子成像研究的肽類探針較少。Hui等[11]利用噬菌體庫篩選技術篩選出了環(huán)形九肽CGNSNPKSC，簡稱GX1，可與人胃癌血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合。Xin等[12]用新合成的花青染料CyIC標記GX1，構(gòu)建了探針 CyIC-GX1，并在小鼠胃癌移植瘤腫瘤模型中進行了研究，結(jié)果顯示CyIC-GX1可與腫瘤組織發(fā)生特異結(jié)合，腫瘤部位熒光信號強度明顯高于周圍正常組織，且熒光持續(xù)時間較長。Liu等[9]從噬菌體庫中篩選出環(huán)形七肽CTKNSYLMC，簡稱GEBP11，該肽也可與胃癌組織血管內(nèi)皮細胞發(fā)生特異性結(jié)合，利用異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記，構(gòu)建FITC-GEBP11，用于小鼠胃癌移植瘤模型及人離體組織標本研究。該探針經(jīng)尾靜脈注射24 h后進行共聚焦激光顯微內(nèi)鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）小鼠在體成像，結(jié)果顯示腫瘤組織顯示明顯高于周圍正常組織的熒光信號；此外，利用探針FITC-GEBP11與新鮮的人胃癌離體組織標本共同孵育30 min后進行CLE成像，結(jié)果顯示93%（26/28）的胃癌離體組織標本顯示不同強度的熒光信號。Zhang等[13]從噬菌體庫中篩選出了靶向CD44的短肽RP-1，在細胞水平證明RP-1可與CD44陽性的胃癌腫瘤細胞發(fā)生特異性結(jié)合。Hwang等[14]篩選出可與肝細胞生長因子（cMet蛋白）穩(wěn)定結(jié)合的環(huán)形肽aML5-FL，同樣利用小鼠胃癌移植瘤模型證明了該探針與腫瘤組織的特異性結(jié)合。目前尚無用于胃癌在體研究的探針，其研究水平仍僅限于動物腫瘤模型，且肽類探針的安全性有待進一步研究。

2.2結(jié)直腸腫瘤及癌前病變 近年來，多數(shù)研究利用小鼠腫瘤模型或人離體組織標本進行了熒光分子成像研究。Liu等[15]使用Cy5.5標記篩選出來的可與結(jié)腸不典型增生性病變特異性結(jié)合的八肽QPIHPNNM構(gòu)建探針Cy5.5-QPIHPNNM進行小鼠腫瘤模型在體研究。發(fā)現(xiàn)在體局部應用5 min后病變組織可見明顯熒光信號，且明顯高于對照組，表明該探針可有效區(qū)分腫瘤組織和正常組織。整合素是細胞表面跨膜糖蛋白，與細胞黏附、細胞信號通路有關，也是腫瘤重要靶點之一。整合素αvβ3在腫瘤血管生成、細胞轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，有75%的結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）存在αvβ3高表達。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）是 一 種 靶 向 α5β1、α8β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8和αⅡbβ3 的短肽[16,17]。Verbeek等[18]使用近紅外熒光染料ZW800-1標記cRGD，構(gòu)建探針cRGD-ZW800-1，對鼠結(jié)直腸癌移植瘤模型經(jīng)尾靜脈注射1 nm探針24 h后進行熒光成像，結(jié)果顯示腫瘤組織熒光信號明顯高于正常組織，此外與單純的染料ZW800-1相比，背景干擾信號明顯降低，但唯一不足的是靜脈應用該探針的作用時間較長。R01是一種經(jīng)化學合成的特異性靶向αvβ6的胱氨酸結(jié)肽，Rabinsky等[19]篩選出可特異性靶向緊密連接蛋白-1（Claudin-1）的七肽RTSPSSR，利用Cy5.5標記后用于熒光成像，結(jié)果顯示該探針能很好的靶向結(jié)腸鋸齒狀腺瘤和腫瘤組織（鋸齒狀腺瘤一直被認為是檢出率極低的癌前病變）。Zhou等[20]篩選出可與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）胞外區(qū)第2結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合肽QRHKPRE，熒光標記構(gòu)建探針Cy5.5-QRHKPRE用于人離體組織標本免疫熒光成像，結(jié)果顯示該探針敏感度達90%，特異度達93%。Zhang等[21]使用熒光染料A740標記R01，構(gòu)建探針A740-R01，發(fā)現(xiàn)小鼠尾靜脈注射探針1 h后腫瘤組織特異性熒光信號信噪比可達（8.27±0.87）。

表1 熒光分子成像的各類探針優(yōu)缺點對比

除上述動物腫瘤模型研究，目前也有少數(shù)探針已完成人在體成像研究。Burggraaf等[22]從M13噬菌體庫中篩選出可與人酪氨酸激酶c-Met特異性結(jié)合的環(huán)形肽序列 GE-137（AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK），用花青染料Cy5**標記后對15名結(jié)直腸癌高?；颊哌M行在體成像研究，發(fā)現(xiàn)靶向熒光探針結(jié)合熒光成像（122處）對病變的檢出數(shù)與白光內(nèi)鏡（101處病變）相比多出21處，有29%的腺瘤在WL/FI雙模式下被檢出，其中有19%的病變只能利用熒光成像才能觀察到，表明熒光成像能進一步提高腫瘤檢出率，更重要的是，該探針的使用在短期內(nèi)對人體并未產(chǎn)生明顯的不良反應。此外，Joshi等[23]的研究結(jié)果也證明了熒光分子成像可有效提高早期病變的檢出率。

2.3其他應用研究 有研究表明，肽類探針在動物在體成像方面具有良好的成像效果。此外，利用噬菌體庫篩選出來的肽不僅可用于腫瘤組織成像，還可用于腫瘤靶向治療。Hu等[24]使用篩選出來的血管靶向肽GX1與腫瘤毒素結(jié)合構(gòu)建GX1-rmhTNF用于胃癌的靶向治療研究，結(jié)果顯示GX1-rmhTNF具有很好的抗腫瘤潛能，不僅可增加rmhTNF在腫瘤部位的聚集，同時也能減少腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）對機體的不良反應。因此，未來可將腫瘤組織成像與治療相結(jié)合，利用肽類探針實現(xiàn)腫瘤在體診療一體化。

單一的成像模式總是會存在一定不足，多模態(tài)成像可取長補短，進一步提高腫瘤成像效果。Yan等[25]利用探針Fe3O4-GX1-Cy5.5同時進行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和光學雙模態(tài)成像，將MRI高分辨率的組織學成像和光學成像高靈敏度的功能成像結(jié)合來提高胃癌的早期診斷率，結(jié)果顯示多模態(tài)成像可有效地提高腫瘤分辨率。

3 展 望

隨著噬菌體庫技術的發(fā)展，更多的肽類探針被篩選出來，并在腫瘤分子成像領域顯示出廣闊的應用前景。此外分子成像與內(nèi)鏡技術相結(jié)合對消化道腫瘤的診斷與治療也具有重要的臨床意義。如今關于肽類探針的研究雖取得可觀的結(jié)果，但目前仍存在以下不足：（1）雖然短肽探針通過與靶細胞特異性結(jié)合可進行疾病的診斷，但在肽類探針的篩選與應用方面，除目前明確的作用位點整合素和c-Met外，多數(shù)肽類探針的作用靶點未知，且肽序列未顯示受體配體同源性，可能對人體具有潛在毒性；（2）肽類探針不能同時用于腫瘤的治療，或許可結(jié)合免疫治療，實現(xiàn)腫瘤診療一體化；（3）目前用于胃腸道腫瘤靶向肽的缺乏也從另一方面反映了腫瘤發(fā)生發(fā)展的復雜性及腫瘤標志物的缺乏，未來仍需更多的努力去研究腫瘤的發(fā)生與發(fā)展機制以及腫瘤特異性抗原的篩查。此外，多模態(tài)成像和診療一體化也是未來分子成像領域重要的發(fā)展方向之一。

【參考文獻】

[1]Siegel R L, Miller K D, Jemal A. Cancer statistics, 2018[J]. CA Cancer J Clin, 2018 , 68（1）: 7-30. DOI: 10.3322/caac.21442.

[2]Levin B, Lieberman D A, McFarland B,et al. Screening and surveillance for the early detection of colorectal cancer and adenomatous polyps, 2008: a joint guideline from the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology [J]. CA Cancer J Clin, 2008, 58（3）: 130-160.DOI: 10.3322/CA.2007.0018.

[3]Lee J H, Wang T D. Molecular endoscopy for targeted imaging in the digestive tract [J]. Lancet Gastroenterol Hepatol, 2016, 1（2）: 147-155. DOI: 10.1016/S2468-1253(16)30027-9.

[4]Smith G P. Filamentous fusion phage: novel expression vector that display cloned antigens on the viron surface [J].Science, 1985, 228（4705）: 1315-1317.

[5]Deutscher S L. Phage display in molecular imaging and diagnosis of cancer [J]. Chem Rev, 2010, 110（5）: 3196-3211. DOI: 10.1021/cr900317f.

[6]Lunder M, Bratkovic T, Urleb U,et al. Ultrasound in phage display: a new approach to nonspecific elution [J].Biotechniques, 2008, 44（7）: 893-900. DOI: 10.2144/000112759.

[7]Noppe W, Plieva F, Galaev I Y,et al. Chromato-panning:an efficient new mode of identifying suitable ligands from phage display libraries [J]. BMC Biotechnol, 2009, 9: 21.DOI: 10.1186/1472-6750-9-21.

[8]Liu Y, Adams J D, Turner K,et al. Controlling the selection stringency of phage display using a microfluidic device [J].Lab Chip, 2009, 9（8）: 1033-1036. DOI: 10.1039/b820985e.

[9]Liu L, Yin J, Liu C,et al. In vivo molecular imaging of gastric cancer in human-murine xenograft models with confocal laser endomicroscopy using a tumor vascular homing peptide [J]. Cancer Lett, 2015 , 356（2PtB）: 891-898. DOI: 10.1016/j.canlet.2014.10.036.

[10]Aoraha E, Candreva J, Kim J R. Engineering of a peptide probe for β-amyloid aggregates [J]. Mol Biosyst, 2015,11（8）: 2281-2289. DOI: 10.1039/c5mb00280j.

[11]Hui X, Han Y, Liang S,et al. Specific targeting of the vasculature of gastric cancer by a new tumor-homing peptide CGNSNPKSC [J]. J Control Release, 2008, 131（2）: 86-93. DOI: 10.1016/j.jconrel.2008.07.024.

[12]Xin J, Zhang X, Liang J,et al. In vivo gastric cancer targeting and imaging using novel symmetric cyanine dyeconjugated GX1 peptide probes [J]. Bioconjug Chem, 2013,24（7）: 1134-1143. DOI: 10.1021/bc3006539.

[13]Zhang D, Jia H, Wang Y,et al．A CD44 specific peptide developed by phage display for targeting gastric cancer [J].Biotechnol Lett, 2015, 37（11）: 2311-2320. DOI: 10.1007/s10529-015-1896-z.

[14]Hwang D W, Bahng N, Ito K,et al．In vivo targeting of c-Met using a non-standard macrocyclic peptide in gastric carcinoma [J]. Cancer Lett, 2017, 385: 144-149. DOI:10.1016/j.canlet.2016.10.030 .

[15]Liu Z, Miller S J, Joshi B P,et al. In vivo targeting of colonic dysplasia on fluorescence endoscopy with nearinfrared octapeptide [J]. Gut, 2013, 62（3）: 395-403. DOI:10.1136/gutjnl-2011-301913.

[16]Handgraaf H J M, Boonstra M C, Prevoo H A J M,et al.Real-time near-infrared fluorescence imaging using cRGDZW800-1 for intraoperative visualization of multiple cancer types [J]. Oncotarget, 2017, 8（13）: 21054-21066. DOI:10.18632/oncotarget.15486.

[17]Barczyk M, Carracedo S, Gullberg D. Integrins [J]. Cell Tissue Res, 2010, 339（1）: 269-280. DOI: 10.1007/s00441-009-0834-6.

[18]Verbeek F P, van der Vorst J R, Tummers Q R,et al. Nearinfrared fluorescence imaging of both colorectal cancer and ureters using a low-dose integrin targeted probe [J]. Ann Surg Oncol, 2014（Supple 4）: S528-S537. DOI: 10.1245/s10434-014-3524-x.

[19]Rabinsky E F, Joshi B P, Pant A,et al. Overexpressed claudin-1 can be visualized endoscopically in colonic adenomas in vivo [J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2015,2（2）: 222-237. DOI: 10.1016/j.jcmgh.2015.12.001.

[20]Zhou J, Joshi B P, Duan X,et al. EGFR overexpressed in colonic neoplasia can be detected on wide-field endoscopic imaging [J]. Clin Transl Gastroenterol, 2015, 6: e101. DOI:10.1038/ctg.2015.28.

[21]Zhang C, Kimura R, Abou-Elkacem L,et al. A cystine knot peptide targeting integrin αvβ6 for photoacoustic and fluorescence imaging of tumors in living subjects [J].J Nucl Med, 2016, 57（10）: 1629-1634. DOI: 10.2967/jnumed.115.169383.

[22]Burggraaf J, Kamerling I M, Gordon P B,et al. Detection of colorectal polyps in humans using an intravenously administered fluorescent peptide targeted against c-Met [J].Nat Med, 2015, 21（8）: 955-961. DOI: 10.1038/nm.3641.

[23]Joshi B P, Dai Z, Gao Z,et al. Detection of sessile serrated adenomas in the proximal colon using wide-field fluorescence endoscopy [J]. Gastroenterology, 2017, 152（5）: 1002-1013. DOI: 10.1053/j.gastro.2016.12.009.

[24]Hu H, Yin J, Wang M,et al. GX1 targeting delivery of rmhTNF evaluated using multimodality imaging [J]. Int J Pharm, 2014, 461（1-2）: 181-191. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2013.11.016.

[25]Yan X, Song X, Wang Z. Construction of specific magnetic resonance imaging/optical dual-modality molecular probe used for imaging angiogenesis of gastric cancer [J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2017, 45（3）: 399-403. DOI:10.3109/21691401.2016.1167701.