市售蒲公英片HPLC特征圖譜建立及其單咖啡酰酒石酸、菊苣酸含量測(cè)定

,3 ,3 ,3 ,5*

1.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000；2.藥用特種昆蟲開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000；3.中國(guó)西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000；4.四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)，四川 成都 610000；5.云南民族大學(xué)南亞東南亞輻射研究中心，云南 昆明 650504

蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁、黃花三七等，為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz、堿地蒲公英TaraxacumborealisinenseKitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草。蒲公英中含有黃酮類、酚酸類、萜類、色素類植物甾醇類等化合物[1]，具有抗炎、抑菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化、降糖等作用[2-5]，常用于治療疔瘡腫毒、乳癰、目赤、肺癰、腸癰、濕熱黃疸和熱淋澀痛等癥[6]。蒲公英片是以蒲公英水提醇沉干浸膏制得，具有清熱解毒的功效，主要用于咽喉腫痛(急性扁桃體炎)、瘡癤[1]，收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第三冊(cè)，但該標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)蒲公英片做相關(guān)的含測(cè)要求，對(duì)該品種的質(zhì)量控制缺乏全面性和客觀性[7]。中藥特征圖譜可以通過系統(tǒng)性、整體性和特征性等特點(diǎn)評(píng)價(jià)蒲公英中所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量，對(duì)于蒲公英片的質(zhì)量控制具有重要意義[8]。近年來，有部分關(guān)于蒲公英藥材的特征圖譜研究相繼報(bào)道，分別以其藥材中綠原酸、咖啡酰、阿魏酸、蘆丁、木犀草素等常見酚酸類化學(xué)成分進(jìn)行特征圖譜指認(rèn)[9-10]，但是尚未建立蒲公英片主要特征峰的HPLC特征圖譜及含量測(cè)定方法。

筆者對(duì)市售7個(gè)廠家的蒲公英片展開特征圖譜研究，采用“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并首次確認(rèn)蒲公英片特征圖譜中的特征峰單咖啡酰酒石酸和菊苣酸，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，為蒲公英片的質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)為后續(xù)藥理活性研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AKSW-V-16艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(成都艾柯水處理設(shè)備有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent 公司)；Sepax Gp-C18色譜柱(4.6×250mm，5μm，美國(guó)賽分)； 已腈、三氟乙酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 材料 對(duì)照品菊苣酸(批號(hào)：20140704，99.3%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)；單咖啡酰酒石酸(批號(hào)：PRF8052505，純度>98%，成都柯瑞法科技開發(fā)有限公司)。市售7個(gè)廠家的蒲公英片，均執(zhí)行部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第三冊(cè)WS3-B-0648-91，標(biāo)示量均為每片含干浸膏0.3克，分別產(chǎn)自河南A廠(批號(hào)：1607023)、河南B廠(批號(hào)：160509)、河南C廠(批號(hào)：160301)、河南D廠(批號(hào)：160305)、廣西E廠(批號(hào)：150420)、山西F廠(批號(hào)：20151002)、吉林G廠(批號(hào)：04160303)。

2 方法與結(jié)果

2.1 單咖啡酰酒石酸與菊苣酸含量測(cè)定

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取單咖啡酰酒石酸5.1 mg、菊苣酸5.0 mg于25 mL棕色量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻，即得204 μg/mL的單咖啡酰酒石酸和200 μg/mL菊苣酸的對(duì)照品溶液，分別取混標(biāo)溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中，加入超純水定容致刻度線，搖勻，既得系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取各廠家蒲公英片20片，去除包衣后研碎，精密稱取該粉末400.0 mg于具塞錐形瓶中，精密加入70 %乙醇10 mL，稱重，超聲處理(功率300 W，頻率54 Hz)30 min，放冷，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足差重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液1.0 mL過0.22 μm微孔濾膜，即得濃度為40 mg/mL供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Sepax Gp-C18(4.6×250 mm，5μm)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：323 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸-乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸-水，洗脫梯度：0～13 min，11%A 等梯度洗脫；14～22 min，17%A等度洗脫；22～29 min，17%～27%A梯度洗脫；29～43 min，27%～34%A梯度洗脫；43～50 min，34%～95%A梯度洗脫。理論塔板數(shù)按菊苣酸峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。取混合對(duì)照品溶液、空白溶液及供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果表明，供試品及混合標(biāo)準(zhǔn)品中各峰分離度及對(duì)稱性良好，色譜圖如圖1所示。

2.1.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

待測(cè)成分回歸方程r線性范圍/μg單咖啡酰酒石酸Y=2857 3X-27 210 999910 2～204 0菊苣酸Y=2899 2X-29 170 999910 00～200 0

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的峰面積的RSD分別為1.09%、1.44%，表明精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片，各精密稱量6份，按2.1.2項(xiàng)下配制供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積并代入表1標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量(μg/mg)。結(jié)果顯示單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的平均含量分別為1.43 μg/mg、1.29 μg/mg，RSD值分別為0.99%、1.09%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示24 h內(nèi)單咖啡酰酒石酸峰面積的RSD為0.67%；菊苣酸峰12h內(nèi)的面積的RSD為0.61%，即供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片，各精密稱量6份，精密加入對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下配制供試品溶液，測(cè)定單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 蒲公英片中單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的加樣回收實(shí)驗(yàn) (n=6)

2.1.9 供試品測(cè)定 取7個(gè)廠家的蒲公英片，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配置供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件記錄單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的峰面積，并計(jì)算其含量，見表3。

表3 不同廠家蒲公英片中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量測(cè)定 (mg/g)

2.2 特征圖譜的測(cè)定與相似度分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sepax Gp-C18(4.6×250mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：323 nm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸-乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸-水，洗脫梯度：0～13 min，11%A 等梯度洗脫；14～22 min，17%A等度洗脫；22～29 min，17%～27%A梯度洗脫；29～43 min，27%～34%A梯度洗脫；43～50 min，34%～95%A梯度洗脫。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片，各精密稱量1份，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，平行測(cè)定6次，以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間無明顯變化，RSD<2%，符合HPLC特征圖譜檢驗(yàn)要求，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間在12 h內(nèi)無明顯變化，RSD<2%，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取山西F廠(批號(hào)：20151002)蒲公英片，各精密稱量6份，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，平行測(cè)定，以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間無明顯變化，RSD<2%，符合HPLC特征圖譜檢驗(yàn)要求，表明重復(fù)性良好。

2.2.5 蒲公英片特征圖譜測(cè)定 按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件對(duì)7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖2。采用“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件得出色譜峰1～9為7個(gè)不同廠家蒲公英片的共有峰，依次確認(rèn)色譜峰1～9為蒲公英片的特征峰，并且在相同HPLC條件下，3、4、5、6、7的保留時(shí)間分別與沒食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對(duì)照品的保留時(shí)間一致，其中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸分離度較好，且含量較高、穩(wěn)定，故選擇單咖啡酰酒石酸和菊苣酸為參照峰(S)。

2.2.6 特征圖譜的相關(guān)性分析 將“2.2.1”項(xiàng)下所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，采用多點(diǎn)校正將譜峰自動(dòng)匹配，平均數(shù)法設(shè)置參照?qǐng)D譜，峰匹配模式得出樣品特征譜圖的共有峰，并計(jì)算相似度，結(jié)果見圖3和表4。由表4可見，7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中，除河南D廠樣品相似度為0.831外，其余樣品相似度均>0.90，差異不明顯，并且1～9色譜峰在7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中均能全部檢出，表明各廠家生產(chǎn)的蒲公英片成分相關(guān)性良好，該色譜條件建立的蒲公英片的特征圖譜指標(biāo)穩(wěn)定。

表4 蒲公英片特征圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

3.1 單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為指標(biāo)峰用于蒲公英片的特征圖譜 在蒲公英原料藥材及其制劑的相關(guān)報(bào)道檢索中少見有對(duì)單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的報(bào)道[11]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在蒲公英片中，單咖啡酰酒石酸和菊苣酸有較高的含量、特征性良好，故選取單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為蒲公英片的含測(cè)指標(biāo)及蒲公英片特征圖譜的指標(biāo)峰。結(jié)果表明，蒲公英片在0.1%的TFA乙腈和0.1%TFA水作為流動(dòng)相時(shí)具有較好的分離效果，能夠保證樣品良好的分離度和出峰數(shù)。特征圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，蒲公英片中富含酚酸類物質(zhì)，其中沒食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的含量較高，且均為咖啡酸類衍生物，故選取咖啡酸的特征吸收波長(zhǎng)323 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，且在該波長(zhǎng)下各峰分離度良好，特征性強(qiáng)，峰數(shù)目較多。

3.2 市售7個(gè)廠家蒲公英片的特征圖譜比較分析 對(duì)比分析7個(gè)廠家的蒲公英片發(fā)現(xiàn)，除河南D廠外，其余6個(gè)廠家的蒲公英片具有較高的相似度。通過“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行峰匹配發(fā)現(xiàn)7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中均含有沒食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸，且單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量較高，特征性明顯，特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，表明該方法用于蒲公英片的特征圖譜具有較高的穩(wěn)定性。河南D廠相似度相對(duì)較低可能是原料藥材的選取、原料藥材的質(zhì)量控制或原料藥材的采收季節(jié)、產(chǎn)地、儲(chǔ)存方式等方面的原因，但缺乏實(shí)驗(yàn)論證。

3.3 單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量比較 《中國(guó)藥典》2015版僅在蒲地藍(lán)消炎口服液中有測(cè)定蒲公英中菊苣酸含量的記載，尚無單咖啡酰酒石酸的相關(guān)指標(biāo)考察[7]。研究表明，蒲公英中的單咖啡酰酒石酸和菊苣酸具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗氧化等作用[11]。測(cè)定蒲公英片中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量發(fā)現(xiàn)，河南D廠生產(chǎn)的片劑中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量分別為0.39 mg/g和0.12 mg/g，其余6個(gè)廠家的蒲公英片中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量均高于1.00 mg/g和0.80 mg/g，這可能也是導(dǎo)致河南D廠與其余6廠相似度差別較大的原因之一。單咖啡酰酒石酸和菊苣酸在蒲公英片中有較高的含量和明顯的HPLC特征圖譜，因此，可將單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為蒲公英及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，但是單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量與蒲公英片的療效之間的關(guān)系尚需藥理實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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