普洱熟茶茶多糖對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用研究

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1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.濱州醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是與血脂代謝異常、內(nèi)皮受損、平滑肌細胞增殖和血栓形成等有關(guān)的慢性炎癥性疾病[1-2]。隨著生活水平的提高和人口老齡化的日益嚴重，AS 的發(fā)病率越來越高，成為了世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。研究顯示，異常的脂質(zhì)代謝和慢性炎癥在AS 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。適當調(diào)整血脂水平能有效地降低動脈粥樣硬化發(fā)病率[3-4]。臨床上大多數(shù)降低血膽固醇水平的方法，需要嚴格控制飲食并依賴于藥物，而降血脂藥物的副作用使其應(yīng)用受到了一定程度的限制。因此開發(fā)能夠明顯調(diào)節(jié)血脂的功能食品，對降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率具有重要的意義。普洱茶是云南特有的地理標志產(chǎn)品，是以符合普洱茶產(chǎn)地環(huán)境條件的云南大葉種曬青茶為原料，按特定的加工工藝生產(chǎn)的具有獨特品質(zhì)特征的茶葉。分為普洱生茶和普洱熟茶兩大類型[5]。本次實驗們使用載脂蛋白E基因敲除小鼠(Apolipoprotein E gene knockout mice, ApoE-/-mice)的動物模型，研究普洱熟茶中的茶多糖(Tea polysaccharides，TPS)抗ApoE-/-小鼠高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用，為進一步有效地開發(fā)利用普洱茶，提供科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J 小鼠8只，雄性，(20±2)g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院，SCXK(渝)2007-0008；SPF級C57BL/6J ApoE敲除小鼠24只，雄性，(20±2)g，北京大學(xué)實驗動物中心，SCXK(京)2006-0008。

1.2 受試物劑量設(shè)置及分組

1.2.1 受試物 普洱熟茶茶多糖由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院制備提供，4 ℃低溫冷藏保存。所用茶葉樣品由三個機構(gòu)提供的不同來源的普洱茶熟餅1∶1∶1混合：①云南龍潤茶業(yè)集團云南農(nóng)大龍潤普洱茶學(xué)院監(jiān)制；②中國普洱茶研究院研制，云南省思茅茶樹良種場生產(chǎn)；帕卡；③云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究院西雙版納普洱茶研究院，勐?？h云茶科技有限責(zé)任公司。

1.2.2 動物及分組 24只ApoE-/-小鼠隨機分為3組：ApoE-/-對照組、茶多糖組、洛伐他汀組，每組8只動物；8只C57BL/6J 小鼠為ApoE+/+對照組。4組動物給予基礎(chǔ)飼料，分別給予蒸餾水、茶多糖(500 mg/kg·bw)、洛伐他汀(10 mg/kg·bw)、蒸餾水。采用經(jīng)口灌胃，給藥容量均為0.2ml/10 g，每天早上9∶00～11∶00給藥一次，連續(xù)給藥12周[6-8]。

1.3 儀器 TMS-1024全自動生化分析儀(日本京都)；Diagnostics Ins.KDC-2046離心機(中國科技大學(xué)科技實業(yè)總公司中佳光電儀器分公司)； BIO-RAD 550酶標儀(美國BIO-RAD公司)；Leica ASP200脫水機、Leica RM2145切片機、Leica EG1160包埋機均為德國萊卡公司；Nikon 50i顯微鏡及Mivnt圖像分析系統(tǒng)(北京唯恩視信科技有限公司)。

1.4 觀察指標

1.4.1 實驗結(jié)束后，所有動物禁食不禁水12 h，摘眼球取血，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取血清，放入-80 ℃ 冰箱冷凍待測。檢測甘油三酯(Triglyceride, TG)、總膽固醇(Total Cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的含量；ELISA檢測血清白介素-6(Interleukin-6, IL-6)及脂聯(lián)素(Adiponectin, APN)。

1.4.2 從主動脈弓到髂總動脈分叉處摘取主動脈全段進行病理組織學(xué)檢查。以“?”表示主動脈基本正常；“+”表示輕度病變，內(nèi)膜完整性破壞，有泡沫細胞聚集，病變程度達到脂紋期甚至纖維斑塊期；“++”表示中度病變，病變程度達到纖維斑塊甚至是粥樣斑塊期；“+++”表示重度病變，出現(xiàn)斑塊破裂、血栓、內(nèi)出血、潰瘍、動脈瘤等復(fù)合病變。

2 結(jié)果

2.1 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠體重的影響 普洱熟茶TPS連續(xù)給藥8周、12周后體重均顯著低于ApoE-/-對照組(P<0.05)，提示普洱熟茶TPS有明顯降低ApoE-/-小鼠體重的作用。見表1。

時間/周組別04812ApoE+/+對照組21 4±3 1823 7±2 1326 7±1 8227 8±1 68ApoE-/-對照組25 4±1 34?27 7±1 61?29 8±2 11?31 9±2 12?茶多糖組25 3±1 1326 7±1 4627 5±1 67#27 8±2 35#洛伐他汀組25 5±1 5025 8±1 6328 5±2 62#29 3±1 79#

注：與ApoE+/+對照組同時間段相比，*P<0.05；與ApoE-/-對照組同時間段相比，#P<0.05。

2.2 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠TG、 TC、LDL-C、HDL-C的影響 茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，TC、TG、LDL-C含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示普洱熟茶TPS能降低ApoE-/-小鼠血脂TC、TG、LDL-C水平。茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，HDL-C含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示普洱熟茶TPS能增加ApoE-/-小鼠血脂HDL-C水平。茶多糖組與洛伐他汀組相比，TG、TC、LDL-C及HDL-C水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示普洱熟茶TPS調(diào)節(jié)血脂作用要弱于洛伐他汀組2。見表2。

組別TGTCLDL-CHDL-CApoE+/+對照組0 9±0 232 4±0 350 50±0 325 7±1 05ApoE-/-對照組2 2±0 42?43 8±6 15?27 2±5 75?1 3±0 31?茶多糖組1 8±0 26#15 3±1 67#12 4±1 79#2 2±0 73#洛伐他汀組1 2±0 39#10 1±1 85#9 3±1 38#4 3±1 27#

注：與ApoE+/+對照組相比，*P<0.05；與ApoE-/-對照組相比，#P<0.05.

2.3 主動脈病理學(xué)檢查 由表3、圖1可知，ApoE+/+對照組小鼠主動脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜和外膜未見異常。內(nèi)膜完整，未見泡沫細胞聚集，無動脈粥樣硬化病變形成。ApoE-/-對照組小鼠主動脈壁形成明顯動脈粥樣硬化斑塊，提示AS造模成功。普洱熟茶茶多糖組動脈粥樣硬化程度與ApoE-/-對照組相比明顯減輕，多為早期粥樣硬化。管壁可見輕度隆起和增厚、泡沫細胞聚集，病變程度較ApoE-/-對照組減輕，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠主動脈損傷病變的影響

注：與ApoE-/-對照組相比，#P<0.05。

2.4 普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠血清APN及IL-6的影響 由表4可知，與ApoE-/-對照組相比，普洱熟茶茶多糖組血清APN含量較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示經(jīng)普洱熟茶TPS干預(yù)后，ApoE-/-小鼠APN含量升高。與ApoE-/-對照組相比，普洱熟茶茶多糖組血清IL-6含量較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示經(jīng)普洱熟茶TPS干預(yù)后，ApoE-/-小鼠炎癥因子IL-6水平降低。

組別APNIL-6ApoE+/+對照組25 4±3 825 4±3 1ApoE-/-對照組12 6±4 4?93 7±7 4?茶多糖組17 3±3 1#67 5±8 3#洛伐他汀組23 6±3 4#46 2±6 4#

注：與ApoE+/+對照組相比，*P<0.05；與ApoE-/-對照組相比，#P<0.05。

3 討論

TPS是從茶葉中提取的活性復(fù)合多糖的總稱，包括酸性多糖、中性多糖、雜多糖和糖蛋白復(fù)合物等[9-11]。普洱熟茶屬于后發(fā)酵茶，加工中的渥堆工序存在濕熱作用和微生物酶解，許多化學(xué)成分大幅度下降，而水溶性茶多糖卻大量增加了近5倍。研究顯示，發(fā)酵茶類(烏龍茶、紅茶、普洱熟茶等)茶多糖分子量低于未發(fā)酵茶類，提示發(fā)酵作用可改變茶多糖理化特性，提高茶多糖的含量和活性[12-14]。因而，普洱熟茶TPS的開發(fā)利用具有廣闊的前景。

AS病理過程不僅與血脂代謝異常密切相關(guān)，還與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。高水平TC能致AS；而TG能加速AS和血栓形成的進程；LDL是血漿中主要帶膽固醇的脂蛋白，可被丙二醛等脂質(zhì)過氧化物氧化，被巨噬細胞上的消除受體攝取，并誘發(fā)泡沫細胞的形成，導(dǎo)致AS。實驗結(jié)果顯示，普洱熟茶TPS有調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠血脂的作用，血清TG、TC以及LDL-C降低，HDL-C升高，從而起到抗AS的作用。APN是由脂肪細胞分泌的細胞因子，通過與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、保護血管和抗AS等。IL-6 是一種主要由活化的巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞等分泌的細胞因子，是介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的重要細胞因子[15-16]。ApoE-/-小鼠可形成AS幾乎所有階段的病變，并與人類的病變非常相似，是研究AS發(fā)病機理和干預(yù)措施較理想的動物，故本實驗采用 ApoE-/-小鼠作為實驗組動物，同品系C57BL/6J小鼠(ApoE+/+)作為陰性對照組，考察普洱熟茶TPS對ApoE-/-小鼠AS的作用。實驗結(jié)果顯示，茶多糖組與ApoE-/-對照組相比，APN水平則顯著升高、IL-6水平顯著降低，從病理形態(tài)學(xué)上分析，茶多糖組主動脈粥樣硬化損傷程度亦比ApoE-/-對照組減輕。提示給予普洱熟茶TPS 12周后，ApoE-/-小鼠炎癥介質(zhì)水平降低，炎癥程度減輕，抗AS作用可能與其提高脂聯(lián)素水平從而抑制炎癥因子IL-6等生成有關(guān)。

綜上所述，普洱熟茶TPS可能通過調(diào)節(jié)血脂紊亂，抑制炎癥反應(yīng)來減緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進程，我們的研究可為普洱熟茶TPS抗AS的開發(fā)利用提供新的思路。

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