加味通幽湯對(duì)缺氧條件下食管癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)和增殖的影響

玉玲 *

1.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北 唐山 063210

在世界范圍內(nèi)，我國(guó)的食管癌發(fā)病率和死亡率均位居各國(guó)之首。我國(guó)的食管癌病理類型以鱗癌為主，約占食管癌總數(shù)的95%左右。食管鱗癌具有進(jìn)展迅速、早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，絕大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較多，總體預(yù)后較差，嚴(yán)重危害人們健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)，血管生成擬態(tài)是對(duì)傳統(tǒng)腫瘤血管生成理論的補(bǔ)充。腫瘤增生過(guò)快造成腫瘤微環(huán)境始終處于相對(duì)缺氧和代謝紊亂狀態(tài)，這是惡性腫瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn)之一。研究表明缺氧可觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列應(yīng)激性保護(hù)反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞在沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞的參與下，表型出現(xiàn)轉(zhuǎn)化，通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑直接形成特有的微循環(huán)管道，這種管道能夠執(zhí)行微血管功能，部分彌補(bǔ)了因?yàn)檠苄律鷾笥诹鲶w生長(zhǎng)所造成的氧和營(yíng)養(yǎng)供給的缺乏，促進(jìn)腫瘤迅速增長(zhǎng)[4-7]。

食管癌在中醫(yī)屬于“噎膈”范疇，“金元四大家”之一李東垣所著《蘭室秘藏》記載有“通幽湯”，是治療瘀血內(nèi)結(jié)，濁氣不降之噎膈[8]的代表方，筆者結(jié)合中藥藥理研究成果[9-14]，創(chuàng)制加味通幽湯，獲得國(guó)家發(fā)明專利(ZL201110308544.0)，全方由桃仁、紅花、升麻、檳榔、半枝蓮和白花蛇舌草6味中藥組成。方中活血化瘀藥桃仁、紅花與行氣散結(jié)藥升麻、檳榔抑瘤效果顯著；半枝蓮、白花蛇舌草中含有的黃酮類、總多糖、皂苷等具有顯著的抑瘤和促凋亡作用，臨床廣泛應(yīng)用于包括食管癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤。本研究觀察了加味通幽湯對(duì)缺氧條件下食管癌Eca109細(xì)胞VM形態(tài)和細(xì)胞增殖的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 4～6周齡SD雄性大鼠，體重200～400 g，清潔級(jí)，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK-(軍)2014-0001。人食管癌 Eca109 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.2 藥物與試劑 加味通幽湯(桃仁5 g，紅花15 g，升麻10 g，檳榔5 g，半枝蓮15 g，白花蛇舌草15 g)，各單味藥物均購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店。

新生牛血清(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，1640培養(yǎng)基(CORNING公司)，PBS緩沖液(BI公司)，10%水合氯醛，Matrigel膠，CCK8(Amersco公司)，10×CoCl2(Sigma公司)，Milli-Q水(Milli-pore公司Milli-Q超純水設(shè)備生產(chǎn))。

1.3 儀器與材料 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司); 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司); 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司); 移液管(gibcol公司); 離心管(gibcol公司); 3MK型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司); 1100型無(wú)菌超凈臺(tái)(美國(guó)Forma公司); 3366型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司); TMD-2倒置式顯微鏡(日本Nikon公司); NOVAPATH 450型酶標(biāo)光度計(jì)(美國(guó)Bio-Tek公司)。

2 方 法

2.1 方藥制備 加味通幽湯加入30倍體積的水，浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮40 min，收集藥液，入燒杯中濃縮方藥至200 mL，-20℃凍存，用時(shí)調(diào)至所需濃度。

2.2 大鼠血清制備 4～6周齡SD大鼠40只，將其隨機(jī)分為兩組(對(duì)照組15只，含藥組25只)，對(duì)照組和含藥組分別灌胃0.9%的生理鹽水和加味通幽湯。調(diào)整加味通幽湯濃度：以標(biāo)準(zhǔn)成人用量為基礎(chǔ)，按照大鼠體表面積與人體換算系數(shù)，計(jì)算大鼠所需生藥量(14.2mg/mL)，以Milli-Q水調(diào)整藥液濃度。

兩組大鼠灌胃量均為1mL/d，連續(xù)灌胃14 d。最后1次灌胃后12h，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上層血清。將提取到的血清56℃恒溫水浴滅活加熱30 min后，在超凈臺(tái)中用針式濾器(0.22μm)過(guò)濾除菌，放入EP管中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及種板(96孔) 以含有10%的FBS和1%的雙抗1640培養(yǎng)基10 mL接種Eca109細(xì)胞于100 mm2培養(yǎng)皿中，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，PBS沖洗后用0.25%胰酶消化，離心反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度10000個(gè)/mL，每孔接種150μL的懸液，培養(yǎng)1 d。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 24孔板每孔加入300μL Matrigel膠(冰上操作)，置于培養(yǎng)箱30min使其凝固，每孔給予1000μL各實(shí)驗(yàn)組單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1d。倒置顯微鏡(×200)下觀察拍攝細(xì)胞形態(tài)。

2.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取出96孔板，棄培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為A組(對(duì)照組)、B組(缺氧組)、C組(含藥血清對(duì)照組)、D組(含藥血清治療組)。A組： 10%對(duì)照大鼠血清、90%1640空白培養(yǎng)基；B組： 10%對(duì)照大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導(dǎo)液和80%1640空白培養(yǎng)基；C組：10%含藥大鼠血清、90%1640空白培養(yǎng)基；D組：10%含藥大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導(dǎo)液和80%1640空白培養(yǎng)基。每孔分別加入各組所需培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1d后，每孔加入10μL的CCK8，培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)OD值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差別顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 加味通幽湯對(duì)細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響 4組培養(yǎng)24 h后形態(tài)發(fā)生明顯變化。鏡下觀察，對(duì)照組Eca109細(xì)胞成團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，無(wú)明顯規(guī)律。缺氧組細(xì)胞則相互連接，成單條或多條管狀結(jié)構(gòu)。在給藥后細(xì)胞都發(fā)生了凋亡。含藥血清對(duì)照組細(xì)胞分散無(wú)規(guī)律，而含藥血清治療組細(xì)胞聚集成團(tuán)狀或條索狀沒(méi)有出現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)。如圖1所示。

3.2 加味通幽湯對(duì)缺氧條件下細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)給予加味通幽湯刺激后，各組間Eca109細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯差異(如圖2所示)。與對(duì)照組相比，Eca109細(xì)胞給予CoCl2處理后，細(xì)胞活性明顯降低，此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。Eca109細(xì)胞給予含藥血清處理后與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性無(wú)明顯變化(P=0.867)。然而，CoCl2刺激Eca109細(xì)胞后給予含藥血清治療，細(xì)胞活性與含藥血清對(duì)照組和缺氧組相比，細(xì)胞活性均有所下降，此差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。提示加味通幽湯進(jìn)一步抑制缺氧誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞活性。

4 討論

食管癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)是其高發(fā)區(qū)[15]，約占全球的50%，同時(shí)也是死亡率最高的國(guó)家[16]。中醫(yī)理論認(rèn)為其重要病機(jī)是內(nèi)傷飲食、情志不遂互為因果[17]。陳無(wú)擇在《三因極一病證方論·卷八》中指出：“喜怒不常，憂思過(guò)度，恐慮無(wú)時(shí)，郁而生涎，涎與氣搏，升而不降，逆害氣滯……與五膈同，但此在咽嗌，故名五噎”，說(shuō)明憂思郁怒導(dǎo)致氣機(jī)郁滯，氣滯或津停生痰，或瘀血內(nèi)生，交阻于食道，妨礙飲食。古今醫(yī)家認(rèn)為惡性腫瘤患者體內(nèi)血行不暢、瘀血內(nèi)停，現(xiàn)代臨床也證實(shí)了血瘀是腫瘤形成發(fā)展的主要病理機(jī)制。故治療當(dāng)以活血祛瘀、行氣散結(jié)。本實(shí)驗(yàn)所使用的加味通幽湯由白花蛇舌草、半支蓮、升麻、檳榔、桃仁、紅花組成，其中桃仁、紅花活血祛瘀；半支蓮、白花蛇舌草可解除體內(nèi)之瘀毒；檳榔下行而破氣滯，升麻升清而降濁陰，一升一降，胃氣乃通。全方緊扣食管癌的病機(jī)，以行氣、活血、祛瘀、滋養(yǎng)陰血為主要功效。

惡性腫瘤的存活和生長(zhǎng)離不開血液供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞可以在缺氧情況下模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞形成一種功能上類似于正常血管的通道，形成另一種腫瘤供血系統(tǒng)，這種血供不需要內(nèi)皮細(xì)胞的參與，但其內(nèi)部含有紅細(xì)胞和血漿，并且還可以與常規(guī)的內(nèi)皮血管相溝通，構(gòu)成血液輸送網(wǎng)絡(luò)，即血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重要的作用,并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。惡性程度高的腫瘤才能形成VM，而低度的惡性腫瘤不能形成，這是因?yàn)閻盒猿潭雀叩哪[瘤生長(zhǎng)迅速，更容易形成缺氧的微環(huán)境；另一方面惡性濃度高的腫瘤分化差，腫瘤細(xì)胞的多能性高，遂能夠模擬內(nèi)皮細(xì)胞并具備相應(yīng)的功能。由于VM的結(jié)構(gòu)特殊，使腫瘤細(xì)胞與血流之間的屏障減弱，容易脫落隨血液運(yùn)輸而轉(zhuǎn)移，從而增高了癌轉(zhuǎn)移的幾率。

本實(shí)驗(yàn)VM形態(tài)學(xué)觀察顯示，對(duì)照組Eca109細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集生長(zhǎng)，給藥后的含藥血清對(duì)照組使細(xì)胞分散并出現(xiàn)凋亡。在給予缺氧誘導(dǎo)后，細(xì)胞惡性程度加重，形成了VM管道以獲得足夠的氧氣。含藥血清治療組的細(xì)胞雖呈現(xiàn)團(tuán)塊聚集生長(zhǎng)但是未出現(xiàn)VM，并且呈現(xiàn)不同程度的凋亡。說(shuō)明加味通幽湯對(duì)Eca109細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成起到了顯著的抑制作用。

惡性增殖是腫瘤細(xì)胞最主要的特征，不斷增多的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致耗氧量增加，造成腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境，促進(jìn)VM形成，增加細(xì)胞氧供，從而形成“細(xì)胞增殖-缺氧-VM-再增殖”的循環(huán)，而未發(fā)生VM的區(qū)域常伴隨細(xì)胞缺氧凋亡。本研究CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和含藥血清對(duì)照組細(xì)胞活性無(wú)差異，缺氧組和含藥血清治療組細(xì)胞活性明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，提示缺氧導(dǎo)致細(xì)胞活性降低；另外，含藥血清治療組細(xì)胞增殖低于缺氧組，說(shuō)明缺氧的Eca109細(xì)胞對(duì)加味通幽湯更敏感，加味通幽湯進(jìn)一步抑制缺氧組細(xì)胞活性，影響其形成VM。

本研究表明加味通幽湯對(duì)食管癌的Eca109細(xì)胞VM形成有顯著抑制作用，對(duì)Eca109細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，但臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

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