基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良的進(jìn)展與挑戰(zhàn)

基因組編輯技術(shù)是指可以在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)改造的遺傳操作技術(shù)，其在基因功能研究和改造、生物醫(yī)學(xué)和植物遺傳改良等方面都具有重大的應(yīng)用價值?？茖W(xué)家自20世紀(jì)90年代末就開始探索基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的新突破和人工核酸內(nèi)切酶（EEN）技術(shù)的出現(xiàn)，將特異識別并結(jié)合DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域和EEN融合，創(chuàng)造出能夠特異切割DNA序列的核酸酶（SSNs），從而可以對基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行高效和精確的靶向編輯。

圖1：SSNs介導(dǎo)的DSBs及其修復(fù)途徑

一、基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上的應(yīng)用進(jìn)展

目前，在作物遺傳改良上應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)三種類型。其中CRISPR/Cas系統(tǒng)包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2等亞類型，但應(yīng)用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚無在作物改良上應(yīng)用的報道。

上述三類基因組編輯技術(shù)均能對植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)的定點(diǎn)敲除、插入和替換，對于控制作物重要農(nóng)藝性狀基因的功能鑒定、作物重要性狀的遺傳改良具有巨大的應(yīng)用價值。與傳統(tǒng)的常規(guī)育種相比，基因組編輯技術(shù)能直接對目標(biāo)性狀基因進(jìn)行修飾，大幅度提高了目標(biāo)性狀聚合的精準(zhǔn)度，加快了聚合育種的進(jìn)程。近年來，對該技術(shù)的優(yōu)化及在作物遺傳改良上的應(yīng)用已成為各國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)的重點(diǎn)。

（一）ZFNs技術(shù)及其應(yīng)用

ZFNs技術(shù)被稱為第一代基因組編輯技術(shù)，是一種人工改造而成的核酸內(nèi)切酶，由鋅指蛋白的DNA結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域組成。其中，DNA結(jié)合域通常由3-6個鋅指結(jié)構(gòu)域（Zincfingerdomain，ZFD）串聯(lián)而成。一個ZFD能特異識別DNA鏈上3個連續(xù)的核苷酸堿基，多個ZFD串聯(lián)后就能特異識別較長的核苷酸序列。近年來，ZFNs技術(shù)已成功應(yīng)用于人類干細(xì)胞、大鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、煙草和玉米等生物體的基因組編輯。但是ZFNs的構(gòu)建難度較大，普通分子實(shí)驗(yàn)室難以操作，且成本高。

（二）TALENs技術(shù)及其應(yīng)用

TALENs是繼ZFNs之后的第二代基因組編輯技術(shù)。TALEN的DNA結(jié)合域?yàn)樘烊坏幕蚪?jīng)改造的TAL效應(yīng)子（TALeffector，TALE）蛋白結(jié)構(gòu)域。TALE重復(fù)區(qū)的每個重復(fù)單元能特異識別一個特定的核甘酸堿基，多個重復(fù)單元串聯(lián)后就能特異識別較長的核苷酸序列。與ZFN相比，TALEN載體的構(gòu)建相對簡單、成本更低、普通的分子生物實(shí)驗(yàn)室也能操作。此外，TALEN技術(shù)基于重復(fù)單元與核苷酸堿基一對一的識別模式，特異性更強(qiáng)，靶向編輯的效率更高。

2012年，LI等首次利用TALENs技術(shù)對水稻白葉枯病感病基因Os11N3（SWEET14）啟動子中的效應(yīng)蛋白結(jié)合元件（effector-bindingelement，EBE）進(jìn)行定點(diǎn)編輯，有效阻止了水稻白葉枯菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo）分泌的效應(yīng)蛋白（AvrXa7和PthXo3）與Os11N3啟動子結(jié)合，使該基因不受Xoo的誘導(dǎo)表達(dá)，從而提高了水稻的白葉枯病抗性。2014年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)利用TALENs技術(shù)同時靶向突變小麥MLO，證明TALENs技術(shù)能對小麥這樣的多倍體植物進(jìn)行定向遺傳改良。

（三）CRISPR/Cas9技術(shù)及其應(yīng)用

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌抵御病毒和外源DNA入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為兩大類。第一大類由多個Cas蛋白組成的復(fù)合體行使生物學(xué)功能，第二大類由單個Cas蛋白（如Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2）行使生物學(xué)功能。CRISPR/Cas9屬于II類，僅需要成熟的crRNA（CRISPR-derivedRNA）、tracrRNA（trans-activatingRNA）和Cas9蛋白就能實(shí)現(xiàn)對外源DNA的切割。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單、編輯效率高、容易實(shí)現(xiàn)多基因編輯等優(yōu)勢，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行定向修飾，能不同程度地改良作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和株型等，是作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種的新途徑。此外，通過CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除作物抗性負(fù)調(diào)控因子基因，或定點(diǎn)修飾抗逆性正調(diào)控基因的啟動子以增強(qiáng)基因的表達(dá)，或?qū)剐韵嚓P(guān)基因編碼區(qū)定點(diǎn)替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

LI等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻產(chǎn)量負(fù)調(diào)控基因Gn1a（每穗實(shí)粒數(shù)）、DEP1（直立型密穗）、GS3（粒長和粒重）和IPA1（穗粒數(shù)、分蘗相關(guān)）進(jìn)行定點(diǎn)修飾，發(fā)現(xiàn)Gn1a或DEP1、GS3突變后水稻的每穗實(shí)粒數(shù)或著粒密度、粒長都明顯增加，但DEP1突變體在著粒密度增加的同時有半矮化現(xiàn)象，而GS3突變體在粒長增加的同時芒也顯著增長。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所趙開軍團(tuán)隊(duì)以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsERF922，獲得的T2純合突變系在苗期和分蘗期對稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高。SHI等利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將玉米GOS2啟動子定點(diǎn)插入ARGOS8的5′-非翻譯區(qū)或直接替換ARGOS8的啟動子，獲得ARGOS8表達(dá)量顯著增加的突變體。這是目前首次報道利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)量來改良作物遺傳性狀的案例。2016年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院莊楚雄團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進(jìn)行特異性編輯，創(chuàng)制了一批溫敏核雄性不育系。

（四）CRISPR/Cpf1技術(shù)及其應(yīng)用

CRISPR/Cpf1隸屬于II類typeV-ACRISPR系統(tǒng)，是迄今發(fā)現(xiàn)最簡單、有效的II類CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cpf1特異切割DNA雙鏈的原理與CRISPR/Cas9相似，但其作用機(jī)制不同。Cpf1是Cas蛋白的一種，其功能與Cas9類似，目前AsCpf1（Acidaminococcussp.Cpf1），LbCpf1（LachnospiraceaebacteriumCpf1）和FnCpf1（FrancisellanovicidaCpf1）已被證實(shí)具有DNA切割及執(zhí)行RNA加工的活性。Cpf1蛋白由具有識別sgRNA功能的a-REC區(qū)域和具有核酸酶功能的NUC區(qū)域構(gòu)成。a-REC包含REC1和REC22個識別結(jié)構(gòu)域；NUC主要包含RuvC結(jié)構(gòu)域、WED（wedge）結(jié)構(gòu)域、一種推定的核酸酶（Nuc）結(jié)構(gòu)域和PI（PAM-interacting）結(jié)構(gòu)域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分別負(fù)責(zé)切割靶DNA的非互補(bǔ)鏈及互補(bǔ)鏈的不同位點(diǎn)，由此產(chǎn)生具粘性末端的DSBs。不同于SpCas9（StreptococcuspyogenesCas9），Cpf1僅需一個42-nt的crRNA（3′端有23-nt與靶DNA序列互補(bǔ)），就能對靶DNA雙鏈進(jìn)行切割。研究證明Cpf1核酸酶在人類細(xì)胞中與SpCas9具有相當(dāng)?shù)那懈钚剩沧C實(shí)Cpf1核酸酶在人類細(xì)胞中具有高度的特異性。

目前，CRISPR/Cpf1技術(shù)已成功應(yīng)用于煙草、大豆和水稻的基因組編輯。XU等將LpCpf1分別與precrRNA和加長pre-crRNA融合構(gòu)建了crRNA-Cpf1系統(tǒng)，在水稻中的編輯效率最高可達(dá)41.2%。HU等將LpCpf1和crRNA整合開發(fā)了CRISPR-Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)水稻內(nèi)源基因的定點(diǎn)編輯。TANG等針對Cpf1蛋白及crRNA的表達(dá)特性，構(gòu)建了PolII型啟動子融合核酶（ribozyme）驅(qū)動的Cpf1和crRNA植物表達(dá)單元，并成功對水稻內(nèi)源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5進(jìn)行定點(diǎn)突變。WANG等將四個DR（directrepeats）-guide單元組成的crRNA分別與FnCpf1和LbCpf1融合構(gòu)建CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)簡單、高效地實(shí)現(xiàn)了水稻多基因定點(diǎn)編輯。

（五）利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方式上的技術(shù)創(chuàng)新

單堿基突變可引起作物許多農(nóng)藝性狀的改變，因此，實(shí)施單堿基編輯對作物遺傳改良具有十分重要的意義。2016年，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院朱健康團(tuán)隊(duì)將APOBEC1通過非結(jié)構(gòu)化的16殘基肽XTEN作為接頭，融合到Cas9（D10A）的N末端，并將核定位信號（NLS）肽添加到Cas9（D10A）的C末端，構(gòu)建了APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)對水稻NRT1.1B和SLR1進(jìn)行編輯，結(jié)果表明該系統(tǒng)能在靶位點(diǎn)產(chǎn)生預(yù)期的C→T（G→A）堿基替換，NRT1.1B和SLR1在靶位點(diǎn)產(chǎn)生預(yù)期突變的效率分別為2.7%和13.3%。

二、基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于作物改良的基本原則

（一）ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉擇

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術(shù)，但三者在設(shè)計、特異性和效率上各有不同。ZFNs由于特異性不高、脫靶問題嚴(yán)重及獲得ZFN蛋白非常困難，嚴(yán)重阻礙了其廣泛應(yīng)用。TALENs的優(yōu)點(diǎn)是特異高、脫靶效應(yīng)低，但載體構(gòu)建較繁瑣、編輯效率不是很高、且難以同時對多個基因進(jìn)行編輯。CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是編輯效率非常高，設(shè)計和構(gòu)建極其簡單，但CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性稍差，存在較明顯的脫靶效應(yīng)，另受PAM識別位點(diǎn)限制。

（二）基因敲除還是基因替換？

目前，基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良主要有兩種方式，一是通過靶向敲除目標(biāo)性狀負(fù)調(diào)控基因，造成該基因功能缺失，以改良目標(biāo)性狀；二是通過對目標(biāo)性狀控制基因進(jìn)行定點(diǎn)替換，導(dǎo)致該基因功能發(fā)生改變，從而獲得新的目標(biāo)性狀。因此，在實(shí)踐中運(yùn)用基因組編輯技術(shù)對作物進(jìn)行遺傳改良時也要分以下兩種情況：一是對于目標(biāo)性狀起負(fù)調(diào)控作用的基因采取基因敲除的方式，目前，絕大部分基于基因組編輯技術(shù)的作物遺傳改良都是通過此方式實(shí)現(xiàn)的，如水稻稻瘟病抗性的改良、水稻溫敏核雄性不育系的創(chuàng)制等；二是對于目標(biāo)性狀的獲得是因目標(biāo)基因突變導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變的基因，采用基因定點(diǎn)替換的方式，如抗除草劑水稻、玉米等都是通過基因定點(diǎn)替換而獲得的。

（三）靶位點(diǎn)如何選擇

在作物遺傳改良的實(shí)際操作中，是敲除多基因還是單基因、靶位點(diǎn)在基因上的位置及數(shù)目都是需要考慮的。如果需要同時改良多個目標(biāo)性狀，以及目標(biāo)性狀是由微效多基因或多等位基因控制的情況，最好針對每個目標(biāo)性狀控制基因，或微效多基因等設(shè)計多個靶位點(diǎn)進(jìn)行定向敲除，能最快、最省地獲得改良目標(biāo)性狀。如果控制目標(biāo)性狀的是主效基因，則敲除單個基因一般即可達(dá)到改良目的。

靶位點(diǎn)在基因上的位置也比較重要，進(jìn)行基因敲除時，靶位點(diǎn)應(yīng)優(yōu)先選擇在起始密碼子附近，或在特定的功能域（可能引起密碼子缺失和移碼）；而如果是基因替換，靶位點(diǎn)則需選擇在基因特定功能區(qū)（突變后基因功能發(fā)生改變的區(qū)域）。此外，靶位點(diǎn)的數(shù)量也關(guān)系到定向編輯的效率和遺傳轉(zhuǎn)化的規(guī)模。

三、基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上應(yīng)用的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

基因組編輯技術(shù)從出現(xiàn)至今不過短短十多年時間，但其已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。特別是TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后，極大地加快了作物分子育種的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已成為基因編輯應(yīng)用的首選，廣泛應(yīng)用于生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良，主要是通過定點(diǎn)突變靶標(biāo)基因，造成基因功能缺失以實(shí)現(xiàn)性狀改良，故敲除的基因必須都是目標(biāo)性狀負(fù)調(diào)控基因。但作物許多性狀改良都需要獲得基因功能，因此，基因組定點(diǎn)替換或插入的基因組編輯具有更廣泛的應(yīng)用前景，而植物細(xì)胞中同源重組效率很低，目前植物基因組編輯技術(shù)對基因單堿基替換、片段定點(diǎn)插入和替換等編輯的效率還很低。因此，對大部分控制重要農(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因目前還無法高效、精準(zhǔn)地進(jìn)行編輯，極大地限制了基因編輯技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于作物遺傳改良的發(fā)展。

綜上所述，基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為作物分子育種提供了新的機(jī)遇，但仍然面臨政策法規(guī)和技術(shù)優(yōu)化兩方面的挑戰(zhàn)。在植物基因功能研究和作物遺傳改良方面，基因編輯技術(shù)具有其他分子技術(shù)無法比擬的巨大優(yōu)勢和機(jī)遇。隨著大量作物品種全基因組測序的完成和越來越多重要農(nóng)藝性狀不利基因被發(fā)現(xiàn)，基因組編輯技術(shù)必將在作物遺傳改良和品種培育上發(fā)揮巨大的作用。