TET2蛋白下調(diào)5hmC在膀胱癌細(xì)胞T739中低表達(dá)

謝梅茂　王忠軍　胡映秋

【摘要】 目的：研究膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中TET2蛋白及5hmC的表達(dá)量相關(guān)作用。方法：采用Real-time PCR檢測正常尿路上皮細(xì)胞和膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中TET2 mRNA的表達(dá)，并同時采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測正常尿路上皮細(xì)胞和膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中5mC及5hmC表達(dá)，了解TET與膀胱癌的作用關(guān)系，并探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果：TET2 mRNA在正常膀胱細(xì)胞T24中的表達(dá)（1.400 00±0.057 74，n=3），顯著高于膀胱癌T739細(xì)胞[（0.866 70±0.120 20，n=3），P=0.016 1]；TET2蛋白在T739中表達(dá)（1.589 00±0.048 52，n=3）也明顯低于T24[（1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7]。5-mC在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.097 6）；5-hmC的表達(dá)量T739細(xì)胞明顯低于T24細(xì)胞

[（1.840 00±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1）]。結(jié)論：TET2 mRNA和蛋白水平在膀胱腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，顯著低于正常膀胱細(xì)胞；且TET2與5hmC低表達(dá)存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 TET2； 5hmC； 膀胱癌

TET2 Protein Downregulates Low Expression of 5hmC in Bladder Cancer Cell T739/XIE Meimao，WANG Zhongjun，HU Yingqiu，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：036-039

【Abstract】 Objective：To study the expression of TET2 protein and 5hmC in bladder urothelial carcinoma cells.Method：Real-time PCR was used to detect the expression of TET2 in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells mRNA，and at the same time immunohistochemical staining was used to detect 5mC and 5hmC in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells，TET and bladder cancer，and its possible mechanism of action was explored.Result：The expression of TET2 mRNA in normal bladder cells in

T24（1.400 00±0.057 74，n=3），was significantly higher than that of T739 cells of bladder cancer[（0.866 70

±0.120 20，n=3），P=0.016 1].The expression of TET2 protein in T739 was significantly lower than that of T24[（1.589 00±0.048 52，n=3） VS （1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7].There was no significant difference in the expression level of 5-mC between two kinds of cells（P=0.097 6）.The expression level of 5-hmC was significantly different，and the T739 cell group was significantly lower than that of T24 cell group[（1.840 00

±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1].Conclusion：TET2 mRNA and protein levels are low expression in bladder tumor cells，significantly lower than those of normal bladder cells，and there is a correlation between the low expression of TET2 and 5hmC.

【Key words】 TET2； 5hmC； Bladder cancer

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.009

隨著相關(guān)診療技術(shù)的進(jìn)展，膀胱癌的發(fā)病率與病死率在我國呈現(xiàn)逐年升高趨勢，嚴(yán)重地危害著我國居民健康[1]。75%～85%初診膀胱癌患者為非肌層浸潤性腫瘤，經(jīng)尿道手術(shù)治療后，約20%進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌，患者需行根治性手術(shù)切除膀胱，生活質(zhì)量與預(yù)期壽命均顯著下降[2]。膀胱癌是由多因素綜合作用導(dǎo)致的，一個復(fù)雜的病理過程，與遺傳、環(huán)境、免疫等密切相關(guān)。在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中，許多基因的表達(dá)將出現(xiàn)改變，尤其是腫瘤可通過上調(diào)轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因（metastasis-promoting genes）的表達(dá)以及下調(diào)轉(zhuǎn)移抑制基因（metastasis-suppressor genes）的表達(dá)來獲得一些新的生物學(xué)特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[3]。隨著表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展以及檢測方式的改進(jìn)，5?羥甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）逐漸成為目前的研究熱點(diǎn)。5hmC是由TET蛋白催化5?甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）去甲基化轉(zhuǎn)化而來。近年來，人們對這一有趣的DNA研究有了很大的興趣，了解TET蛋白和5hmC的相關(guān)性，進(jìn)一步了解基因調(diào)控與疾病的關(guān)系。5hmC水平表達(dá)可能在各個方面發(fā)揮著重要作用病理生理過程，如血液學(xué)惡性腫瘤、黑色素瘤、神經(jīng)退行性疾病和老化等[4-7]。然而，5hmC是否與膀胱腫瘤相關(guān)，目前尚無明確報道。本研究，擬通過檢測膀胱癌細(xì)胞及正常膀胱上皮細(xì)胞中TET2及5hmC的表達(dá)，了解膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中TET家族可能所起的作用，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人類膀胱癌細(xì)胞株T739、人膀胱上皮細(xì)胞株T24由中科院上海細(xì)胞庫提供。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自Hyclone公司，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素購自Invitrogen公司。細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，放到37 ℃的條件下，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。最終，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行本研究的相關(guān)實驗操作。

1.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) Real-time PCR檢測T739和T24細(xì)胞中TET2 mRNA的表達(dá)，利用TRIzol試劑（Invitrogen公司）分別提取T739與T24細(xì)胞的總RNA，合成cDNA。反應(yīng)條件：（1）42 ℃ 30 min；（2）99 ℃5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，合成cDNA，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。本研究中采用的TET2 mRNA的引物序列由上海生工生物工程公司合成：上游5-TTCTTCCCCATGACCAC-3下游5-ACGCTTGGAAG CAGGAGAT-3。PCR循環(huán)條件：（1）變性94 ℃ 30秒；（2）退火55 ℃45秒；（3）延伸65 ℃45秒，共循環(huán)30次；（4）72 ℃延伸5 min。分析最終的基因擴(kuò)增結(jié)果，計算Ct值。采用GAPDH作為內(nèi)參。每組設(shè)3個復(fù)孔，基因相對表達(dá)量（RQ）采用2-△△Ct方法計算。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測TET2蛋白表達(dá)量 采用

1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，凱基生物科技有限公司，Ltd，南京，中國）于冰上孵育0.5 h，裂解細(xì)胞。使用BCA蛋白檢測試劑盒（凱基生物科技有限公司）檢測蛋白濃度。細(xì)胞裂解液（16 μg）用6%十二烷基硫酸鈉處理。聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜。采用含5%脫脂牛奶的TBST，室溫封閉1 h。加入一抗，抗TET2（1∶500稀釋，Abcam，美國）在4 ℃過夜。TBST洗滌后，印跡與二抗體孵育（1∶6 000稀釋，cwbio）在室溫下1 h。蛋白質(zhì)密度分析Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)，馬里蘭州，美國）

1.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測5mC和5hmC表達(dá) T739與T24細(xì)胞去除培養(yǎng)基后，采用PBS沖洗3次，5 min/次。PBS清洗后，收集細(xì)胞放置于4%多聚甲醛，37 ℃固定15 min。固定后，再用PBS清洗細(xì)胞3次，5 min/次。將細(xì)胞置入預(yù)冷的甲醇處理10min，處理前甲醛需要置于-20 ℃冰箱預(yù)處理。PBS洗3 次。孵育一抗：5hmC為1∶500，Abcam，美國，4 ℃孵育過夜。一抗孵育后，PBS洗滌細(xì)胞，5 min/次，洗3次。孵育熒光二抗。兩種抗體，抗體稀釋度：AlexaFluor594為1∶800，AlexaFluor488為1∶400。二抗室溫孵育，孵育60 min。PBS清洗后，用50%甘油/PBS封片觀察。采用尼康熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。采用Image ProPlus Version 4.0軟件分析，檢測熒光光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 以上實驗均重復(fù)3次以上。統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS 19.0版（SPSS Inc.，Chicago，IL，美國），實驗結(jié)果用（x±s）表示，先進(jìn)行方差分析（F檢驗），兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測TET2 mRNA的在T739和T24細(xì)胞的表達(dá)水平 TET2 mRNA在T739中的表達(dá)（1.400 00±0.057 74，n=3），顯著高于T24細(xì)胞（0.866 70±0.120 20，n=3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0161），見圖1。

2.2 TET2 蛋白的在T739和T24細(xì)胞的表達(dá)水平 TET2蛋白在T739細(xì)胞中的表達(dá)為（1.589 00

±0.048 52，n=3），T24細(xì)胞為（1.310 00±0.049 33，

n=3），TET2蛋白在T739細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于T24細(xì)胞（P=0.015 7），見圖2。

2.3 5mC和5hmC在T739和T24細(xì)胞的表達(dá)水平比較 5mC在T739和T24細(xì)胞的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.097 6），見圖3；5hmC在T739細(xì)胞中的表達(dá)（1.840 00±0.055 68，n=3）明顯高于T24細(xì)胞（1.487 00±0.041 77，n=3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007 1），見圖4。

3 討論

5hmC是由TET家族蛋白催化產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物，早在幾十年前就被發(fā)現(xiàn)[8]。但是直到最近，研究者才在鼠的腦和胚胎干細(xì)胞中確定了5hmC的高表達(dá)，羥甲基話逐漸被人們所重視[9]。目前研究認(rèn)為，5hmC是去甲基化的中間產(chǎn)物，通過移位或突變產(chǎn)生甲基化表型，從而破壞了TET蛋白質(zhì)的功能。TET蛋白是5hmC的重要調(diào)節(jié)因子[10]。人TET蛋白家族共有3個成員，分別為TET1、TET2和TET3。TET1主要在胎兒組織和干細(xì)胞中表達(dá)，TET2在造血系統(tǒng)中含量較高，而TET3則在結(jié)腸和肌肉等組織中表達(dá)[11]。其中，TET2相關(guān)研究顯示：約有20%骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者可以被檢測出TET2突變；并且，相關(guān)結(jié)果與臨床癥狀存在一定的相關(guān)性；有部分學(xué)者認(rèn)為：TET2可以被作為一種良好的診斷標(biāo)志物，指導(dǎo)精準(zhǔn)治療[12-13]。

在人類的不同組織中，5hmC表達(dá)存在明顯的差異性。采用免疫沉淀等方法，Li等[14]發(fā)現(xiàn)在人腦組織中5hmC高表達(dá)約0.67%，在肝、腎、結(jié)直腸組織中表達(dá)量相對較低，在心、乳腺、胎盤組織內(nèi)表達(dá)量更低，僅為0.05%～0.06%。本研究發(fā)現(xiàn)但去甲基化5mC即5hmC在腫瘤細(xì)胞中，也存在高表達(dá)的趨勢。相對于T24的表達(dá)量，TET2作為5hmC的重要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞T739中mRNA和蛋白水平均明顯降低，這與腫瘤與低甲基化水平相類似的結(jié)果。DNA甲基化，是最早被學(xué)者發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳的修飾形式。TET2基因維持CpG島的局部DNA甲基化，從而起到了阻止腫瘤細(xì)胞CPG異常甲基化的作用[15]。

最近的一項報告顯示，腦部病變，特別是星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，隨著腫瘤級別升高，5mC水平?jīng)]有明顯變化，但可以顯著降低5hmC[16]；其他的研究也顯示，相比于正常組織，腫瘤會降低5hmC的水平[17-18]。國內(nèi)的一些學(xué)者在其他實體癌的相關(guān)研究中，也得到了相類似的結(jié)果：謝素紅等[19]通過應(yīng)用小干擾RNA沉默TET1基因表達(dá)，可顯著下調(diào)腎癌786-O細(xì)胞中TET1蛋白的表達(dá)水平，明顯抑制786-O細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞阻滯于G1期，其機(jī)制可能與TET1調(diào)控SUZ12的表達(dá)，影響其靶基因?qū)RC2的招募有關(guān)?？赡艿牟孪胧牵篢ET2突變導(dǎo)致活性喪失或功能丟失，阻止了5mC向5hmC轉(zhuǎn)化，從而造成5hmC的降低，但由于體內(nèi)其他代謝途徑維持了5mC的平衡[20]。所以本研究中膀胱癌細(xì)胞中5hmC顯著降低，但與正常細(xì)胞相比5mC水平無明顯變化。

到目前為止，TET2蛋白是否在實體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用仍有待進(jìn)一步研究。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了TET2、5hmC在膀胱腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，提示TET2和5hmC可能成為膀胱癌診斷及治療的新靶點(diǎn)，為了解膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中TET家族可能所起的作用，但具體相關(guān)機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2017-11-30） （本文編輯：程旭然）