七氟烷預(yù)處理對(duì)老年大鼠心肌線粒體敏感性鉀通道的影響

張斌　林宗航　何江

【摘要】 目的：研究七氟烷預(yù)處理對(duì)老年大鼠心臟功能和線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及其機(jī)制。

方法：選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，首先建立穩(wěn)定的離體心臟灌注模型，經(jīng)KH平衡液平衡15 min后隨機(jī)將其分為假手術(shù)組、缺血再灌注（I/R）組、七氟烷預(yù)處理Ⅰ（Sevo Ⅰ）組（0.5 Mac七氟烷）、七氟烷預(yù)處理Ⅱ（Sevo Ⅱ）組（1.0 Mac七氟烷）、Sevo Ⅰ+5-HD組、Sevo Ⅱ+5-HD組，每組10只。比較平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min時(shí)的冠脈血流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP）和左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。觀察灌注末胞漿膜下線粒體（subsarcolemmal mitochondria，SSM）、心肌纖維間線粒體（intermyocardial fiber mitochondria，IFM）的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：再灌注5、15、30 min，Sevo Ⅰ組與Sevo Ⅱ組CF、HR、LVDP均高于I/R組（P<0.01），LVEDP均低于I/R組（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD組CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD組CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ組（P<0.01）。電鏡結(jié)果顯示，Sevo Ⅰ組、Sevo Ⅱ組心肌線粒體形態(tài)保存較好，但聯(lián)合應(yīng)用K通道抑制劑5-HD后（Sevo Ⅰ+5-HD組、Sevo Ⅱ+5-HD組），其保護(hù)效應(yīng)消失。結(jié)論：七氟烷預(yù)處理可增加老年大鼠缺血心臟的CF，減輕缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷，而K通道抑制劑5-HD可以取消七氟烷預(yù)處理對(duì)老年大鼠缺血心肌的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 七氟烷預(yù)處理； 心肌缺血； 細(xì)胞線粒體

Effect of Sevoflurane Preconditioning on Myocardial Mitochondrial Sensitive Potassium Channel in Aged Rats with Ischemic/ZHANG Bin，LIN Zonghang，HE Jiang，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：028-031

【Abstract】 Objective：To study the effects of Sevoflurane preconditioning on cardiac function and mitochondrial morphology in aged rats with ischemia and its mechanism.Method：A total of 60 healthy male SD rats of clean grade were selected.First，establish a stable isolated heart perfusion model，after equilibrium of KH equilibrium liquid equilibrium 15 min，they were randomly divided into sham operation group，ischemia reperfusion group（I/R），sevoflurane preconditioningⅠ （Sevo Ⅰ） group（0.5 Mac Sevoflurane），Sevoflurane preconditioningⅡ（Sevo Ⅱ） group（1.0 Mac Sevoflurane），Sevo Ⅰ+5-HD group，Sevo Ⅱ+5-HD group，10 rats in each group.The coronary flow（CF），heart rate（HR），left ventricular developed pressure（LVDP） and left ventricular end diastolic pressure（LVEDP） after the balance，before ischemia，reperfusion 5，15 and 30 min

were compared.The morphological changes of subsarcolemmal mitochondria（SSM） and intermyocardial fiber mitochondria（IFM） at the end of perfusion were observed.Result：Reperfusion 5，15 and 30 min，the CF，HR and LVDP in Sevo Ⅰ group and Sevo Ⅱ group were higher than those of I/R group（P<0.01），LVEDP were lower than those of I/R group（P<0.01）.The CF，HR and LVDP in Sevo Ⅰ+5-HD group were all lower than those of Sevo Ⅰ group（P<0.01），and LVEDP were higher than those of Sevo Ⅰ group（P<0.01）.The CF，HR and LVDP in Sevo Ⅱ+5-HD group were all lower than that in Sevo Ⅱ group （P<0.01），and LVEDP were higher than those of Sevo Ⅱ group（P<0.01）.Electron microscopy showed that myocardial mitochondria were well preserved in Sevo Ⅰ group and Sevo Ⅱ group，but the protective effect disappeared after combined application of K channel inhibitor 5-HD（Sevo Ⅰ+5-HD group，Sevo Ⅱ+5-HD group）.Conclusion：Sevoflurane preconditioning can increase the CF of ischemic heart in aged rats，alleviate the injury of mitochondria after myocardial ischemia and reperfusion，and K-channel inhibitor 5-HD can cancel the protective effect of sevoflurane preconditioning on ischemic myocardium in aged rats.

【Key words】 Sevoflurane preconditioning； Ischemia myocardial； Myocardial mitochondria

First-authors address：Qingyuan Peoples Hospital，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.007

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌恢復(fù)血供后出現(xiàn)更為嚴(yán)重的心肌功能損傷，是臨床麻醉工作中常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，尤其心臟手術(shù)中多見(jiàn)[1]。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明，給予七氟烷在心肌缺血或復(fù)灌注之初，可誘導(dǎo)產(chǎn)生與缺血預(yù)處理或缺血后處理類(lèi)似的保護(hù)效果，從而減輕心肌缺血損害的程度[2-4]。本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注模型，給予七氟烷預(yù)處理，觀察其對(duì)缺血再灌注大鼠心臟功能及大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響，旨在探討七氟烷預(yù)處理對(duì)MIRI的保護(hù)作用及其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及離體心臟灌注模型的建立 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，20～24月齡，體重320～370 g，由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。腹腔注射肝素對(duì)大鼠進(jìn)行肝素化處理，30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉5 mL/kg用以麻醉大鼠。麻醉成功后，將大鼠置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上并固定，尋找解剖標(biāo)志劍突，沿胸骨下緣剪開(kāi)胸腔，打開(kāi)心包，暴露主動(dòng)脈弓。沿心底部迅速橫斷主動(dòng)脈，將心臟取出并迅速放于4 ℃的無(wú)鈣臺(tái)式液中，輕輕擠去心腔中的殘余血液，游離主動(dòng)脈根部。將離體心臟懸掛于灌注裝置上，經(jīng)主動(dòng)脈泵入飽和臺(tái)式液。整個(gè)灌注裝置提前使用循環(huán)水浴箱進(jìn)行預(yù)熱，心臟的溫度控制為（37±5）℃[5-10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只大鼠，制備離體心臟灌注模型，經(jīng)KH平衡液平衡15 min后隨機(jī)分成以下6組，每組10只。（1）假手術(shù)組：平衡后繼續(xù)灌注KH液75 min；（2）缺血再灌注（I/R）組：平衡后灌注20 min，之后全心停灌25 min，再灌注30 min；（3）七氟烷預(yù)處理Ⅰ（Sevo Ⅰ）組：平衡期后使用0.5 Mac七氟烷飽和的KH液后處理15 min，普通液洗脫5 min，停灌25 min，再改為KH液灌注30 min；（4）七氟烷預(yù)處理Ⅱ（Sevo Ⅱ）組：平衡期后使用1.0 Mac七氟烷飽和的KH液后處理15 min，普通液洗脫5 min，停灌25 min，再改為KH液灌注30 min；（5）Sevo Ⅰ+5-HD組：平衡后使用0.5 Mac七氟烷飽和5-HD（100 μm）的KH液后處理15 min，普通液洗脫5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min；（6）Sevo Ⅱ+5-HD組：平衡后使用1.0 Mac七氟烷飽和5-HD（100 μm）的KH液后處理15 min，普通液洗脫5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min。

1.3 心功能指標(biāo)測(cè)定 穩(wěn)定后切開(kāi)左心耳，經(jīng)左心房、二尖瓣，將連接測(cè)壓導(dǎo)管的球囊送入左心室，測(cè)壓導(dǎo)管的另一端連接多導(dǎo)生理記錄儀。分別在平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min時(shí)測(cè)定冠脈血流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP）和左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

1.4 心肌線粒體的形態(tài)學(xué)觀察 再灌注末取心肌標(biāo)本，采用差速離心法提取胞漿膜下線粒體（subsarcolemmal mitochondria，SSM）、心肌纖維間線粒體（intermyocardial fiber mitochondria，IFM），在高倍電子掃描顯微鏡下觀察兩種線粒體的形態(tài)學(xué)變化[11-13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組離體心臟缺血前后CF比較 平衡后和缺血前，六組離體心臟CF比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。再灌注5、15、30 min，除假手術(shù)組外其他五組CF均低于缺血前及平衡后（P<0.01）；Sevo Ⅰ組與Sevo Ⅱ組CF均高于I/R組（P<0.01）；Sevo Ⅱ組CF均高于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD組CF均低于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD組CF均低于Sevo Ⅱ組（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 六組離體心臟缺血前后HR、LVDP、LVEDP比較 平衡后和缺血前，六組離體心臟HR、LVDP、LVEDP比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。再灌注5、15、30 min，除假手術(shù)組外其他五組HR、LVDP均低于缺血前及平衡后（P<0.01），LVEDP均高于缺血前及平衡后（P<0.01）；Sevo Ⅰ組與Sevo Ⅱ組HR、LVDP均高于I/R組（P<0.01），LVEDP均低于I/R組（P<0.01）；Sevo Ⅱ組HR、LVDP均高于Sevo Ⅰ組（P<0.01），LVEDP均低于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD組HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD組HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ組（P<0.01）。見(jiàn)表2～4。

2.3 線粒體電鏡結(jié)果 假手術(shù)組的正常線粒體：線粒體提取豐度較高，數(shù)目較多，線粒體形態(tài)完整，嵴清晰，少有腫脹，SSM和IFM無(wú)明顯差別。Sevo Ⅰ組、Sevo Ⅱ組線粒體：IFM線粒體數(shù)目較多，形態(tài)完整，嵴清晰部分有空泡、腫脹，少數(shù)破壞；SSM線粒體數(shù)目較IFM少，大多形態(tài)完整，嵴較為清楚，部分有腫脹、空泡。I/R組、Sevo Ⅰ+5-HD組、Sevo Ⅱ+5-HD組線粒體：IFM線粒體數(shù)目明顯減少，線粒體中度腫脹，部分嵴排列紊亂、不清楚，變性甚至破裂；SSM線粒體數(shù)目減少明顯，殘存線粒體多腫脹，基質(zhì)丟失，視野充滿線粒體碎片。

3 討論

當(dāng)今社會(huì)，急性心肌梗死仍是威脅人類(lèi)生命的首要病因。心肌I/R損傷仍是不能實(shí)現(xiàn)急性心肌梗死患者心肌有效再灌注的主要原因。因此如何能夠既盡早恢復(fù)缺血組織血流，又不發(fā)生再灌注損傷，是缺血性疾病防治中亟待解決的重要課題[11-14]。大量研究表明，線粒體內(nèi)膜上存在敏感性鉀通道對(duì)生物膜的穩(wěn)定性、線粒體及心肌細(xì)胞的功能起著非常重要的作用。同時(shí)，吸入性麻醉藥物如七氟醚、安氟醚、異氟醚等可以通過(guò)影響活性氧、線粒體鉀通道的開(kāi)放及炎癥因子的釋放及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，可減少心肌組織細(xì)胞的缺血再灌注損傷[14-17]。

本研究結(jié)果顯示，再灌注5、15、30 min，Sevo Ⅰ

組與Sevo Ⅱ組CF、HR、LVDP均高于I/R組（P<0.01），LVEDP均低于I/R組（P<0.01）。電鏡結(jié)果顯示，SevoⅠ組、SevoⅡ組預(yù)處理有效地保護(hù)了再灌注大鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的完整，有利于再灌注期間心肌細(xì)胞和線粒體功能的恢復(fù)，提示七氟烷預(yù)處理能夠?qū)θ毖俟嘧⑿募∑鸬奖Ｗo(hù)作用。本研究在Sevo Ⅰ組、Sevo Ⅱ組預(yù)處理時(shí)選擇用線粒體敏感性鉀通道阻滯劑5-HD（100 μm）共同灌注15 min后洗脫。結(jié)果顯示，再灌注5、15、

30 min，Sevo Ⅰ+5-HD組CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ組（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD組CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ組（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ組（P<0.01）。電鏡結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用K通道抑制劑5-HD后（Sevo Ⅰ+5-HD組、Sevo Ⅱ+5-HD組），其保護(hù)效應(yīng)消失，表明K通道抑制劑5-HD可以取消七氟烷預(yù)處理對(duì)老年大鼠缺血心肌的保護(hù)作用，提示七氟烷預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)作用很可能是通過(guò)開(kāi)放線粒體鉀通道實(shí)現(xiàn)的[18-20]。

綜上所述，七氟烷預(yù)處理可以對(duì)老年大鼠缺血再灌注心臟收縮功能受損和線粒體結(jié)構(gòu)完整性起到一定程度的逆轉(zhuǎn)和保護(hù)作用，這一發(fā)現(xiàn)為臨床使用吸入性麻醉藥七氟烷預(yù)防MIRI提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-10-16） （本文編輯：董悅）