甲基蓮心堿對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Bcl—2、Bax及Caspase—3表達(dá)影響的研究

蔣朝龍 史高峰 李虎 高鳳山

[摘要]目的：研究甲基蓮心堿對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3 中mRNA和蛋白表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞及正常皮膚組織，隨機(jī)分為4組：對照組、甲基蓮心堿低、中、高劑量組（5、10、20μg/ml）。各組分別加入不同濃度藥物培養(yǎng)24h后，采用RT-PCR檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表達(dá)，并運(yùn)用Western Blot檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，低劑量組Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)量均無明顯變化（P>0.05）；中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯降低，Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與對照組相比，低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量無明顯變化，中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低、中、高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：甲基蓮心堿能上調(diào)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Bax、Caspase-3的表達(dá)，同時下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]甲基蓮心堿；增生性瘢痕成纖維細(xì)胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3

[中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）03-0107-03

Research of Influence of Neferine on Expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in Hypertrophic Scar Fibroblast

JIANG Zhao-long，SHI Gao-feng，LI Hu，GAO Feng-shan

（Department of Plastic Surgery，Affiliated Hoapital，Jiangnan University，Wuxi 214062，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To research the influence of neferine on the expression of mRNA and protein in Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast. Methods Hypertrophic scar fibroblasts and normal skin tissue were cultured in vivo and randomly divided into four groups， namely， the control group， low， medium and high dose groups of neferine（5，10，20μg/ml）. After drugs with different concentrations are respectively added into each group for culture for 24 hours， the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA was detected by RT-PCR， and the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 protein was detected by Western Blot. Results Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA in the low dose group（P>0.05）. The expression of Bcl-2 in medium and high dose group decreased obviously， and the expression of Bax and Caspase-3 significantly increased（P<0.05）. Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2 protein in the low dose group， and the expression of Bcl-2 in the middle and high dose groups decreased significantly（P<0.05）. And the expression of Bax and Caspase-3 in the low， middle and high dose groups increased obviously（P<0.05）. Conclusion Neferine can upregulate the expression of Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast and downregulate the expression of Bcl-2 therein as well.

Key words： neferine； hypertrophic scar fibroblasts； Bcl-2； Bax； Caspase-3

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar）往往由手術(shù)、外傷及燒傷造成，發(fā)病機(jī)制與延長的炎癥反應(yīng)及傷口愈合增殖有關(guān)[1]。成纖維細(xì)胞增殖及凋亡異常與增生性瘢痕的形成密切相關(guān)[2]。臨床治療方法有手術(shù)切除、激光、放療等，但毒副作用大及復(fù)發(fā)率高，故值得進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制和防治藥物[3]。甲基蓮心堿（neferine）是從睡蓮科植物蓮的成熟種子綠色胚芽中提取的生物堿，屬雙芐基異喹啉化合物，分子式為C38H44N2O6[4]。有研究發(fā)現(xiàn)其能抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖[5]，但其具體作用機(jī)制仍未闡明。有報道發(fā)現(xiàn)其能通過線粒體途徑誘導(dǎo)HSC-T6凋亡，具體機(jī)制與Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)改變有關(guān)[4]。本實驗研究甲基蓮心堿對瘢痕成纖維細(xì)胞Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)的影響，以分析其抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 試劑與儀器：甲基蓮心堿（CHENGDU MUST Bio-technology）；DMSO（美國Sigma公司）；marker和瓊脂糖（Promega公司）；2×Taq MasterMix（康為世紀(jì)）；引物合成（北京奧科鼎盛生物技術(shù)公司）；RNA 提取試劑盒fastgen200（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin 多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。CO2恒溫箱（Thermo公司）；超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）；RT-PCR儀（AB Applied Biosystems）；電泳儀（美國BIO-RAD公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（培清科技）。

1.2 標(biāo)本來源：增生性瘢痕組織取自江南大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科的增生性瘢痕患者。均符合增生性瘢痕的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后病理診斷與臨床診斷一致，且患者無長期外用抗瘢痕藥物史，不合并腫瘤及其他嚴(yán)重疾病。同時取4例其他外科手術(shù)患者創(chuàng)緣的正常皮膚組織，均無結(jié)締組織疾病，無心、肺、肝、腎等慢性疾病，近期未使用過糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物等，且未接受過放療。

1.3 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。取新鮮增生性瘢痕組織，用0.5%新潔爾滅漂洗2次，每次3min，再用0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗。在無菌工作臺內(nèi)，去除表皮及皮下組織。在少量胎牛血清中將瘢痕組織剪成0.5～1mm大小的組織塊，接種于塑料培養(yǎng)皿中，組織塊間距約0.5mm，在5%CO2，37℃飽和濕度和95%空氣條件下培養(yǎng)4h，使組織塊粘附，然后加入1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清，青、鏈霉素各100U/ml）適量，繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5d換液1次。3～4周后，待原代細(xì)胞生長基本融合成片時，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1：2或1：3的比例分種傳代培養(yǎng)，以后每3～5d傳代一次。取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。以2×104個/孔細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，從次日起，每天用血球計數(shù)器計數(shù)3孔細(xì)胞，計算均值。

1.4 實驗分組：使用DMSO溶解甲基蓮心堿。實驗分為4組，即對照組、甲基蓮心堿低、中、高劑量組（5、10、20μg/ml）。取對數(shù)期生長細(xì)胞，培養(yǎng)于6孔板上，每孔加入2ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞生長至50%時，更換培養(yǎng)基為無血清DMEM，饑餓24h，再更換為10% FBS的DMEM，同時加入各組藥物培養(yǎng)24h，進(jìn)行RT-PCR及Western Blot實驗。

1.5 RT-PCR測定各組細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平：采用RNA提取試劑盒fastgen 200提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa法，反應(yīng)體系為10μl，內(nèi)含500ng RNA，5×PrimeScript Buffer 2μl，最后RNase free H2O定容到10μl，按反應(yīng)條件37℃ 15min，85℃ 5s 在RT-PCR儀上反應(yīng)，冷卻至-20℃ 保存。PCR反應(yīng)體系為25μl，內(nèi)含cDNA 2μl，上、下游引物各加入0.5μl（引物序列見表1），2×Taq Master Mix 12.5μl，RNase free H2O 9.5μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃后延伸5min，冷卻至4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20ng/L瓊脂糖凝膠電泳并照相，用Gel-pro Analyzer軟件進(jìn)行灰度分析，以各因子條帶與內(nèi)參條帶的光密度比值代表其mRNA相對表達(dá)水平。每個實驗組重復(fù)5次。

1.6 Western Blot檢測各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：收集經(jīng)0、5、10、20μg/ml甲基蓮心堿處理24h后的細(xì)胞，PBS洗滌，加入裂解液，置于4℃下裂解15min提取總蛋白，測定蛋白濃度并定量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入1：500稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入1：5 000稀釋的二抗，室溫孵育1h，洗膜3次。應(yīng)用ECL進(jìn)行顯影檢測，以Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的IOD比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析：統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較多組間均數(shù)差異，組間比較應(yīng)用最小顯著差異法（LSD-t）。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)量測定結(jié)果：與對照組相比，低劑量組Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)量均無明顯變化（P>0.05）；中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯降低，Bax及 Caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖1。

2.2 各組細(xì)胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 蛋白表達(dá)量測定結(jié)果：與對照組相比，低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量無明顯變化，中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組相比，低、中、高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3，圖2。

3 討論

增生性瘢痕與創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細(xì)胞過強(qiáng)的功能及細(xì)胞外基質(zhì)的過度累積有關(guān)，組織學(xué)上其主要由平行于皮膚表面的Ⅲ型膠原構(gòu)成[6]。增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性較正常皮膚來源成纖維細(xì)胞增強(qiáng)[7]，同時增生性瘢痕存在眾多凋亡異常，如其中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)比正常皮膚組織高，增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡等[8]。這可能導(dǎo)致增生性瘢痕成纖維細(xì)胞對凋亡產(chǎn)生抵抗，進(jìn)而失控性的生成大量膠原纖維[8]。甲基蓮心堿因具有抗肝臟纖維化的功能廣受關(guān)注，其機(jī)制可能與其抑制肝星狀細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)肝星狀凋亡有關(guān)[4，9]。由于增生性瘢痕的病理生理機(jī)制與肝纖維化存在相似性，因此兩者的研究往往可以相互借鑒。有研究發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿能劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，并能減少移植至裸鼠的人增生性瘢痕的體積，同時改變Ⅰ、Ⅲ型膠原成分，降低膠原和酸性粘多糖含量的作用，但目前尚無對其潛在機(jī)制的研究[5]。本研究即初步探討了甲基蓮心堿抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制。

本實驗發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿能上調(diào)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Bax、Caspase-3的表達(dá)，同時下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。而Bcl-2、Bax及Caspase-3都是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵分子[4]。凋亡主要通過兩條基本通路：死亡受體通路和線粒體通路，其中線粒體通路主要與Bcl-2家族蛋白有關(guān)[10]。線粒體中促凋亡因子的釋放主要受Bcl和Bax的調(diào)控，Bcl和Bax都是線粒體膜相關(guān)的Bcl-2家族蛋白，Bcl與Bax之間的相互作用決定了細(xì)胞的生死[10]。Bcl-2是一種具有抗凋亡活性的膜整合蛋白，它能使細(xì)胞抵抗凋亡。Bax則是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，Bax從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體膜外層后，進(jìn)而與Bcl-2蛋白組成異源二聚體，該二聚體能在線粒體上產(chǎn)生孔道，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放[8]。實驗中發(fā)現(xiàn)隨著甲基蓮心堿濃度的增高，Bcl-2的表達(dá)有下降趨勢，其中中、高劑量組較低劑量組、對照組顯著性降低；同時Bax的表達(dá)有升高趨勢，3個劑量組均較對照組顯著性升高。而Bcl-2的降低和Bax的增高可能通過線粒體通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3作為凋亡中最重要的一個效應(yīng)分子，是多種凋亡信號通路的最終匯集點(diǎn)，也是凋亡的主要執(zhí)行者[11]。實驗中隨著甲基蓮心堿濃度升高，細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)有升高趨勢，且中、高劑量組與對照組、低劑量組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。故Caspase-3的高表達(dá)可能參與了瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡，這可能是甲基蓮心堿抑制該細(xì)胞的潛在機(jī)制。

綜上所述，甲基蓮心堿能下調(diào)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，同時顯著上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，這可能是甲基蓮心堿誘導(dǎo)目的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。本實驗僅研究了甲基蓮心堿對體外培養(yǎng)細(xì)胞的作用，但其對體內(nèi)增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的影響有待進(jìn)一步研究。目前增生性瘢痕尚無理想的治療藥物，甲基蓮心堿因其純天然、毒副作用較小等優(yōu)勢，且符合國家近期扶植中醫(yī)藥發(fā)展的精神，進(jìn)一步研究其抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的機(jī)制，使其有望成為治療增生性瘢痕的一個新選擇。

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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-02-01

編輯/朱婉蓉