丙泊酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK/NF—κB信號(hào)通路活性的影響

汪鑫 雷曉文 陳丹 劉斌

[摘要]目的 研究丙泊酚對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUBECs）p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性的影響。方法 將體外培養(yǎng)的HUBECs隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組）：給予脂肪乳20 mg/L；LPS組（L組）：給予LPS 10 mg/L；丙泊酚組（P組）：給予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS組（PL組）：給予丙泊酚20 mg/L、LPS 10 mg/L。在給予相應(yīng)藥物后1、2、3、6、12 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量變化。結(jié)果 予以給藥1 h時(shí)，L組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為10.32±0.73、60.32±5.73，與C組比較表達(dá)顯著增加（P<0.05）。予以給藥2 h時(shí)，L組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為9.23±0.53、69.23±5.53，與C組比較，表達(dá)顯著增加（P<0.05）；PL組的p-p38 MAPK灰度值為6.32±0.35，與L組比較，顯著降低（P<0.05）。給藥3 h時(shí)，L組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為11.13±0.23、71.13±5.23，與C組比較，表達(dá)顯著增加（P<0.05）；PL組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為8.95±0.21、56.95±5.21，與L組比較，顯著降低（P<0.05）。給藥6 h時(shí)，L組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為12.16±0.20、73.16±4.20，與C組比較，表達(dá)顯著增加（P<0.05）；PL組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為9.65±0.32、58.65±4.32，與L組比較，顯著降低（P<0.05）。給藥12 h時(shí)，L組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為18.19±0.31、91.19±6.31，與C組比較，表達(dá)顯著增加（P<0.05），PL組的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分別為12.65±0.12、63.36±5.12，與L組比較，顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 LPS刺激HUBECs能引起p-p38 MAPK、NF-κB表達(dá)增加，予以丙泊酚后抑制此種增加，這可能是丙泊酚抗炎的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]丙泊酚；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；炎癥

[中圖分類號(hào)] R614.2+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）3（c）-0004-04

[Abstract]Objective To study the influence of Propofol on the activity of p38，MAPK/NF-κ B signal pathway in human umbilical vein endothelial cells （HUBECs） induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods HUBECs cultured in vitro were randomly divided into the 4 groups：control group （group C） was given Intralipid 20 mg/L，LPS group （L group） was given LPS 10 mg/L，Propofol group （P group） was given Propofol 20 mg/L，Propofol+LPS group （PL group） was given Propofol 20 mg/L and LPS 10 mg/L.The change in the content of p38 MAPK，p-p38 MAPK and NF-κB were detected at five time points of 1，2，3，6，and 12 h.Results When administered 1 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 10.32±0.73，60.32±5.73 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.When administered 2 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 9.23 ±0.53，69.23±5.53，which increased significantly compared with group C （P<0.05），and the gray value of PL group was 6.32±0.35，which was significantly lower than that of group L.Administration of 3 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group L was 11.13±0.23，71.13±5.23 respectively，which increased significantly compared with group C（P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 8.95±0.21，56.95±5.21 respectively in group PL，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Administration of 6 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 12.16±0.20，73.16±4.20 respectively in group L，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 9.65±0.32，58.65±4.32 respectively in group PL，which decreased significantly compared with the L group （P<0.05）.Administration of 12 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 18.19±0.31，91.19±6.31 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group PL was 12.65±0.12，63.36±5.12 respectively，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Conclusion LPS stimulating HUBECs can increase the expression of p-p38 MAPK and NF-κB，and inhibit this increase after Propofol injection may be one of the mechanisms of Propofol anti-inflammation.

[Key words]Propofol；Human umbilical vein endothelial cells；Inflammation

丙泊酚因起效快、作用時(shí)間短、可控性好，目前已成為臨床廣泛使用的一線靜脈麻醉藥。丙泊酚除了具有鎮(zhèn)靜麻醉作用外，近年來(lái)研究報(bào)道[1]丙泊酚可以抗氧化應(yīng)激，降低組織代謝率，可能對(duì)缺血缺氧器官具有保護(hù)效應(yīng)。1992年，O′Donnell等[2]報(bào)道，臨床劑量范圍內(nèi)的丙泊酚在體外可抑制中性粒細(xì)胞的極化，并且此作用與丙泊酚劑量成正相關(guān)，自此以后丙泊酚與炎癥反應(yīng)的關(guān)系就逐漸被學(xué)者們關(guān)注并重視。后續(xù)有很多研究報(bào)道[3-5]，支持丙泊酚的抗炎作用。有研究表明[6]，丙泊酚能抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活、相關(guān)炎癥因子的釋放、NO的生產(chǎn)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)通透性，但是丙泊酚抗炎作用的具體機(jī)制，目前仍不完全清楚。本研究采用體外細(xì)胞模型，觀察丙泊酚對(duì)p38 MAPK磷酸化及NF-κB表達(dá)的影響，探討丙泊酚抗炎的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；肽牛血清FBS（Gibco公司，美國(guó)）；新生兒臍帶 鼠抗磷酸化p38抗體（CST公司）；兔辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（CST；鼠抗p38抗體（CST公司）；鼠抗NF-κB抗體（CST公司）；脂肪乳（Sino-Swed Pharmaceutical Corp.Ltd.，中國(guó)）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Escherichia coli O11：B4，Sigma公司，美國(guó)）；化學(xué)發(fā)光液（Pierce公司，美國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取新鮮人臍帶約20 cm長(zhǎng)，用預(yù)溫的D-PBS緩沖液洗去殘血，加0.25%的胰蛋白酶于37℃保溫10 min，用小牛血清終止反應(yīng)，并用D-PBS沖洗消化下來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞，合并終止液。于室溫離心10 min，1000 r/min收集細(xì)胞沉淀，用M199細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮，置于一次性塑料瓶或培養(yǎng)板，37℃，5%CO2，5～7 d可長(zhǎng)成。

1.2.2分組處理 取16個(gè)6 cm皿處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，按照隨機(jī)方法進(jìn)行分組。對(duì)照組（C組）：給予脂肪乳20 mg/L，LPS組（L組）：給予LPS 10 mg/L；丙泊酚組（P組）：給予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS組（PL組）：同時(shí)給予丙泊酚20 mg/l及LPS 10 mg/L。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng) 1、2、3、6、12 h后收集細(xì)胞懸液，于800 r/min，5 min離心 ，離心半徑9.5 cm，棄上清，細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解 30 min，間斷置于漩渦振蕩器振蕩 10 min，4℃離心機(jī)中2000 r/min，離心 15 min，離心半徑13.5 cm取上清使用 Bradford法定量后置于-80℃凍存。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取等量蛋白樣品上樣，以5%的濃縮膠及12%的分離膠行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至大小相同的多聚亞乙烯氧化物（PVDF）膜上。PVDF膜用含 5%脫脂奶粉的洗滌緩沖液 TBST（pH=7.4，TBS中加入 0.1%Tween-20）封閉1 h后，使用TBST緩沖液漂洗3次，把膜放入含有抗 P-p38MAPK（1∶1000）或抗 p-ERK1/2（1∶1000）或抗NF-κB（1∶1000）的一抗稀釋液（TBST中加5%胎牛血清）中常溫孵育1 h后，4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次后，用辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗（1∶2000）室溫下孵育1 h。TBST緩沖液漂洗3次，然后與化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1 min，避光顯色，加入TBS終止反應(yīng)。在Kadak digital science ID多功能圖像工作站采集結(jié)果，分析膜上蛋白條帶灰度值。

1.3觀察指標(biāo)

各組在給予相應(yīng)藥物后1、2、3、6、12 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)p-p38 MAPK表達(dá)的比較

與C組比較，L組和PL組在給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的p-p38 MAPK表達(dá)增加，PL組較L組降低（P<0.05），P組和C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2各組不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)的比較

與C組比較， L組和PL組在給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NF-κB蛋白表達(dá)增加，PL組較L組增加（P<0.05）（表2）。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體內(nèi)重要的效應(yīng)細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)诟腥拘孕菘恕RDS等的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，也是內(nèi)毒素等常見(jiàn)的靶細(xì)胞[7-8]，同時(shí)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源廣泛，因此本研究選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，其從細(xì)菌內(nèi)釋放出來(lái)后形成內(nèi)毒素，可介導(dǎo)嚴(yán)重感染，感染性休克，多器官功能障礙等[9]。有研究報(bào)道[10]，通過(guò)LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能為臨床治療內(nèi)毒素性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征提供新的治療思路。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)體內(nèi)外各種應(yīng)激的信號(hào)反應(yīng)[11]，p38MAPK是其中一條重要的組成部分。LPS是炎癥反應(yīng)重要的啟動(dòng)因子[12]，它可以激活MAPK家族，使相應(yīng)蛋白磷酸化而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。

臨床上許多需全身麻醉的手術(shù)患者或重癥監(jiān)護(hù)室的患者存在全身感染的狀態(tài)，丙泊酚作為手術(shù)室廣泛應(yīng)用的靜脈全身麻醉藥及ICU鎮(zhèn)靜藥[14-15]，因其具有抗炎作用逐漸受到人們的關(guān)注[16-19]。但丙泊酚抗炎作用的具體機(jī)制仍不十分明確，因此，本研究以血管內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)象，研究丙泊酚在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中與MAPK家族磷酸化的關(guān)系。

p38MAPK最初被Han等[20]作為一種LPS刺激巨噬細(xì)胞中的酪氨酸磷酸化蛋白而鑒定出來(lái)。本研究結(jié)果顯示，與L組比較，PL組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)p-p38MAPK磷酸化水平顯著降低，提示丙泊酚抑制炎癥反應(yīng)的作用可能與抑制p38MAPK磷酸化有關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，與L組比較，PL組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NF-κB蛋白表達(dá)含量減低，提示丙泊酚可能通過(guò)抑制p38MAPK磷酸化及NF-κB蛋白表達(dá)來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，丙泊酚可以抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞受到LPS刺激后p38MAPK磷酸化水平增高，抑制NF-κB蛋白表達(dá)，這可能為丙泊酚抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制之一。但是丙泊酚是否通過(guò)改變其他蛋白質(zhì)的表達(dá)，來(lái)抑制MAPK蛋白磷酸化和NF-κB蛋白表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

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