遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理及創(chuàng)傷預(yù)處理對缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用及抗氧化能力的比較

柴青，張可賢，唐育民，李桂芳

(四川省腫瘤醫(yī)院·研究所 麻醉醫(yī)學(xué)中心/四川省癌癥防治中心，四川 成都 610041)

隨著圍術(shù)期醫(yī)學(xué)的提出，臨床麻醉醫(yī)師和外科醫(yī)師對合并有各種慢性疾病的老年人的圍術(shù)期安全及其臟器功能保護(hù)越來越重視[1]。在眾多影響圍術(shù)期安全的因素中，組織器官所承受的缺血再灌注損傷是影響病人生存率和死亡率的一個重要因素,1986年Murry等[2]首次提出了缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning，IPC)的概念，指出一個短暫間斷的缺血再灌注過程能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)機(jī)制，從而減輕之后長時間的缺血再灌注損傷。1993年P(guān)rzyklenk等[3]又提出了遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理(remote ischemia preconditioning)的概念，既通過遠(yuǎn)離目標(biāo)器官部位的短暫缺血來達(dá)到保護(hù)目標(biāo)臟器抵御缺血再灌注損傷的目的。2004年Ren等[4]發(fā)現(xiàn)了一種新的心肌保護(hù)現(xiàn)象，他們觀察到給予腹部切口的小鼠，其心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積較對照組明顯減少，他們將這種非缺血預(yù)處理現(xiàn)象命名為“遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理”(remote preconditioning of trauma)。在之后的研究中科學(xué)家指出，腹部切口通過切口部位的傷害性感受器刺激神經(jīng)信號的傳導(dǎo)，通過脊神經(jīng)通路興奮了心臟的交感神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)一些內(nèi)源性介質(zhì)的釋放，產(chǎn)生了對心肌的保護(hù)作用。雖然物理方法的遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理無法在臨床上實踐,但是辣椒素能夠激活皮膚上的C感覺纖維，產(chǎn)生模擬遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，這也為遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理的臨床應(yīng)用提供了一條嶄新的道路。

相較于遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理，遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理方面的研究還很少，這兩種截然不同的預(yù)處理方法誰的心肌保護(hù)作用更強(qiáng)還不得而知，如果兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能增強(qiáng)心肌保護(hù)作用也不確定。鑒于使用藥物可能因為個體差異及使用劑量的不確定性而難以達(dá)到較好的和一致的遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理效果，故本研究采用對大鼠腹部切開的物理方法進(jìn)行遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理，來比較遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理與遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理的優(yōu)劣以及聯(lián)合運(yùn)用的效果，進(jìn)而論證在臨床實際應(yīng)用中這兩者如何取舍，以便于臨床決策的制定。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

50只雄性7周齡SD大鼠，體重250～300 g，由四川省動物中心提供，給予相同飼料喂養(yǎng)于相同環(huán)境下(氣溫23 ℃，濕度60%，12 h的晝夜交替)。用電腦自動生成的隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為5組，實驗流程見圖1。假手術(shù)組，僅開胸；對照組，僅開胸建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠(yuǎn)端創(chuàng)傷缺血預(yù)處理組(創(chuàng)傷缺血組)，腹部正中橫切口開腹2 cm作為創(chuàng)傷刺激，并阻斷雙側(cè)股動脈5 min，再灌注5 min，反復(fù)3個循環(huán)，縫合腹部切口，再建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理組(創(chuàng)傷組)，腹部正中橫切口開腹2 cm,30 min后縫合切口，再建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理組(缺血組)，不開腹，僅阻斷雙側(cè)股動脈5 min，再灌注5 min，反復(fù)3個循環(huán)，再建立心肌缺血再灌注損傷模型。

圖1實驗流程圖

1.2 主要試劑及儀器

大鼠肌鈣蛋白I檢測試劑盒(ELISA)(武漢Uscn生命科學(xué)有限公司)，TUNEL染色試劑盒(美國Promega公司)，4,6- 聯(lián)脒- 2- 苯基吲哚(DAPI)染料(美國Sigma化學(xué)公司)。

小動物呼吸機(jī)和生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，血?dú)夥治鰞x(美國Radiometer Medical Aps.)，離心機(jī)(美國COULTER公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio- Tek儀器公司)，自動生化儀(深圳Mindray公司)，石蠟封片機(jī)、切片機(jī)、熒光顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3 實驗步驟

(1)大鼠稱重并記錄數(shù)據(jù)，用保溫毯保持體溫在37 ℃。(2)予2%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，麻醉滿意后仰臥固定于手術(shù)臺上，術(shù)中每60 min給予25 mg·kg-1的劑量維持麻醉。(3)氣管切開接呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸參數(shù)為：氧濃度40%，呼吸機(jī)頻率60～70次·min-1，潮氣量2.5～3.5 ml，吸呼比1∶2。(4)右頸總動脈置管接換能器記錄心率、血壓。標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連接心電圖。(5)按實驗分組在不同部位予以相應(yīng)預(yù)處理措施，再建立心肌缺血再灌注模型(在左心耳下緣冠狀動脈左前降支中點位置以6- 0帶針線縫扎血管，造成心肌缺血30 min，松開縫線給予再灌注180 min)。實驗過程中注意監(jiān)測、記錄實驗開始前，預(yù)處理后，洗脫期后，心肌缺血后，心肌再灌注1、2、3 h時的血壓水平。(6)冠狀動脈結(jié)扎成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：ST段改變(ST段抬高或下移，T波高聳或倒置)；心律失常(可見室性心律失常如室性早搏、陣發(fā)或非陣發(fā)室性心動過速，房室傳導(dǎo)阻滯和室內(nèi)阻滯等)；結(jié)扎遠(yuǎn)端局部發(fā)白；血壓下降。(7)排除標(biāo)準(zhǔn)：平均動脈壓持續(xù)低于60 mmHg且難以回復(fù)，或者失血過多實驗結(jié)束時血紅蛋白含量低于50 g·L-1。

1.4 標(biāo)本處理及數(shù)據(jù)測定

心肌再灌注180 min后經(jīng)頸動脈置管取血，離心留取上清，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)，自動生化儀測定血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase- MB,CK- MB),酶聯(lián)免疫吸附法測定肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)。

處死大鼠后取其心臟，將心尖到缺血遠(yuǎn)端部位制作石蠟標(biāo)本，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated deoxyuridine triphosphate nick- end labeling assay,TUNEL)行熒光染色，正常細(xì)胞被染成藍(lán)色，凋亡細(xì)胞被染成綠色，熒光顯微鏡下觀察，每個標(biāo)本取5個高倍鏡視野，通過Image J 1.44p軟件計算凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)，AI定義為凋亡細(xì)胞總數(shù)與所有細(xì)胞總數(shù)之比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較使用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)

實驗過程中各組血壓情況見表1。大鼠基礎(chǔ)血壓組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)束時假手術(shù)組血壓最高，為(119±26.2)mmHg，對照組血壓最低，為(101±21.8)mmHg，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)；假手術(shù)組血壓與各實驗組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 大鼠平均動脈血壓 mmHg

a 與假手術(shù)組比，P<0.05

2.2 氧化抗氧化指標(biāo)及心肌損傷標(biāo)記物指標(biāo)

各組血清MDA、SOD、LDH、CK- MB、cTnI測值及比較如圖2。假手術(shù)組及對照組血清MDA水平分別為(3.5±0.6)nmol·ml-1和(4.8±0.7)nmol·ml-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。創(chuàng)傷缺血組為(3.7±1.0)nmol·ml-1,創(chuàng)傷組為(3.7±0.6)nmol·ml-1，缺血組為(3.6±0.8)nmol·ml-1，3個實驗組與假手術(shù)組比較沒有差異，而與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組血清SOD水平為(161.1±39.3)U·ml-1，對照組為(117.4±25.8)U·ml-1，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。創(chuàng)傷缺血組為(176.5±65.6)U·ml-1，創(chuàng)傷組為(195.5±65.5)U·ml-1,缺血組為(171.2±31.0)U·ml-1，與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。血清LDH水平對照組最高，為(911.1±265.5)U·L-1，最低為假手術(shù)組的(290.3±65.9)U·L-1，3個實驗組分別為(511.2±89.9)U·L-1、(616.2±182.2) U·L-1和(622.0±112.5)U·L-1，實驗組與對照組和假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。血清CK- MB水平仍是對照組最高，為(413.0±99.5)U·L-1，假手術(shù)組最低，為(180.5±62.5)U·L-1，對照組與創(chuàng)傷缺血組[(246.0±52.7)U·L-1]、創(chuàng)傷組[(218.2±62.8)U·L-1]、缺血組[(186.0±68.3)U·L-1]之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。cTnI水平在假手術(shù)組最低，為(42.5±6.5)pg·ml-1，對照組最高，為(60.1±12.1)pg·ml-1，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3個實驗組分別為：創(chuàng)傷缺血組(44.1±5.9)pg·ml-1、創(chuàng)傷組(43.7±8.3) pg·ml-1、缺血組(42.7±4.7)pg·ml-1，均與假手術(shù)組無差異，而與對照組比則均有差異。

a 與假手術(shù)組比，P<0.05;b 與對照組比，P<0.05

圖2大鼠血清MDA、SOD、LDH、CK-MB、cTnI箱式圖

2.3 心肌細(xì)胞AI

大鼠心肌細(xì)胞凋亡染色如圖3，心肌細(xì)胞AI統(tǒng)計學(xué)分析如圖4。假手術(shù)組AI最低，為(5.26±4.99)%，與其他4組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組AI最高，為(31.75±10.65)%，創(chuàng)傷缺血組為(18.32±9.30)%，與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)，創(chuàng)傷組為(18.51±9.26)%，與對照組比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)，缺血組為(20.41±3.86)%，與對照組比差異同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)，但3個實驗組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

凋亡細(xì)胞染成綠色，正常細(xì)胞染成藍(lán)色

圖3大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色熒光照片×400

3 討 論

遠(yuǎn)端缺血和創(chuàng)傷預(yù)處理作為兩種比較有前景的預(yù)處理方法，我們的研究對其優(yōu)劣及聯(lián)合應(yīng)用的必要性進(jìn)行了論證。結(jié)果顯示，實驗結(jié)束后3個實驗組的氧化抗氧化指標(biāo)、心肌損傷血清學(xué)指標(biāo)及心肌細(xì)胞AI均與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異，顯示出了預(yù)處理措施對心肌的保護(hù)作用。而3個實驗組之間兩兩比較則差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也就是說無論是單獨(dú)運(yùn)用遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理還是單獨(dú)運(yùn)用遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理，或者兩者聯(lián)合運(yùn)用，均能起到保護(hù)心肌抵抗缺血再灌注損傷的作用，但是聯(lián)合應(yīng)用兩種預(yù)處理方法并不能增強(qiáng)對心肌的保護(hù)作用。

我們認(rèn)為，3種預(yù)處理方式的心肌保護(hù)效果相當(dāng)是由于其作用機(jī)制的殊途同歸導(dǎo)致的。遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理的作用是通過釋放體液介質(zhì)或者神經(jīng)調(diào)質(zhì)或者兩者聯(lián)合來發(fā)揮的[5]，這些介質(zhì)包括腺苷、緩激肽、熱休克蛋白、腫瘤壞死因子- α、一氧化氮、阿片類物質(zhì)等等[6- 8]。而遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理可能主要依靠神經(jīng)途徑發(fā)揮作用，腹部皮膚外周感覺神經(jīng)的疼痛性刺激能夠通過胸9- 10脊神經(jīng)激活心臟的感覺神經(jīng)，使心臟交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素和緩激肽，進(jìn)而發(fā)揮對心臟的保護(hù)作用[9]。但兩者最后通過活性介質(zhì)在心臟局部引起保護(hù)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是相似的，都能引起蛋白激酶C活化，ATP敏感的線粒體鉀通道開放，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)保護(hù)因子合成等[6,9- 12]。

a 與假手術(shù)組比，P<0.05；b 與對照組比，P<0.05

圖4大鼠心肌細(xì)胞AI箱式圖

基于以上結(jié)果我們認(rèn)為，在臨床實踐決策時對于需行腹部大手術(shù)的患者可以不必再給予遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理來保護(hù)其臟器功能，因為其腹部切口已經(jīng)相當(dāng)于對其進(jìn)行了遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理；而對于行腹部手術(shù)以外的其他非心臟手術(shù)的患者以及行微創(chuàng)腔鏡手術(shù)的患者，遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理是不可行的，此時給予遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理就能發(fā)揮一定的臟器保護(hù)作用。

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