瓜蔞皮提取物對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用

甄慶強(qiáng)，張潔，雷震，李猛

(1.萊蕪市人民醫(yī)院 血管外科, 山東 萊蕪 271100;2.鄭州市第八人民醫(yī)院 藥械科, 河南 鄭州 450045;3.河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室, 河南 鄭州 450045)

瓜蔞，葫蘆科植物，是一種常見(jiàn)的中藥，性寒、味甘、微苦。主治肺熱咳嗽，痰濁黃稠，胸痹心痛，結(jié)胸痞滿。果實(shí)剖開(kāi)，除去種子和瓜瓤，剩余部分稱為瓜蔞皮?！吨兴幹尽酚涊d瓜蔞皮：“滌痰結(jié)，舒肝郁。治痰熱咳嗽，胸脅作痛”[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是目前發(fā)病率較高的心血管疾病，是冠心病、腦梗死、心肌梗死等的主要病因[2]，如何控制和治療動(dòng)脈粥樣硬化是近幾年研究的熱點(diǎn)。除高血壓、高血脂、糖尿病、年齡等引起動(dòng)脈粥樣硬化的傳統(tǒng)因素之外，高同型半胱氨酸血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[3]，同型半胱氨酸可通過(guò)多種途徑影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，作者主要是研究瓜蔞皮提取物如何影響同型半胱氨酸誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MTT試劑、同型半胱氨酸購(gòu)自Sigma公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，RT- PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，DMEM購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。蘇木素伊紅HE染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，瓜蔞皮提取物國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027540，購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

智能型全自動(dòng)生化分析儀，意大利Crony公司；ABI97OO擴(kuò)增儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ELx800光吸收酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；X- ZOZB 輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)，上海華巖儀器設(shè)備有限公司；智能型全自動(dòng)生化分析儀，意大利Crony 公司；TG16- 微量高速臺(tái)式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TEC- 2800病理包埋機(jī)，意大利 Histo- line 公司。

1.3 動(dòng)物來(lái)源、分組及建模

60只Wistar健康大鼠，雌雄不限，7周齡，體重180～200 g，購(gòu)于北京生命科學(xué)研究所，在溫度23～25 ℃、相對(duì)濕度40%～60%、光照12 h的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及進(jìn)水。將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組20只、同型半胱氨酸(Hcy)模型組20只、瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組20只。正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；Hcy模型組在基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋氨酸；瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組在1%蛋氨酸飲食同時(shí)用瓜蔞皮提取物(2 g·ml-1)按照15 ml·kg-1的量每日灌胃1次，試驗(yàn)周期為11周[4]。在第11周末給予各組大鼠禁食12 h處理，0.1%的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉后于大鼠頸動(dòng)脈處取血液3 ml，然后室溫靜置約0.5 h，3 000 r·min-1離心15 min，取血清后置于-70 ℃環(huán)境下保存待檢測(cè)。

1.4 血管平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取血液樣本同時(shí)取3組各自Wistar大鼠的胸主動(dòng)脈，根據(jù)組織貼塊法[5]分離培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞。分離的原代細(xì)胞用15%FCS的DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞傳代后用10%FCS的DMEM培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第3～8代細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞分別在培養(yǎng)至第1、2、3、4、5天時(shí)棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，每孔加無(wú)血清培養(yǎng)基100 μl和5 g·L-1MTT 10 μl培養(yǎng)2 h，每孔吸取80 μl培養(yǎng)液，加DMSO 100 μl，轉(zhuǎn)入EP管，用DMSO稀釋至310 μl，立即在ELx800光吸收酶標(biāo)儀吸收波長(zhǎng)490 nm下讀取吸光度值，每組重復(fù)測(cè)6次(n=6)。

1.6 RT- PCR法檢測(cè)細(xì)胞中c- myc及c- fos mRNA表達(dá)

各組細(xì)胞處理24 h后用Trizol試劑提取細(xì)胞中RNA,用紫外分光分析和凝膠電泳檢測(cè)所提取總RNA 的質(zhì)量和濃度。在逆轉(zhuǎn)錄酶(MLV)催化下合成 cDNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)人c- myc、c- fos和β- actin基因的c- DNA序列，按照引物設(shè)計(jì)原則用 Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。 β- actin的上游引物序列為5′- GCC ATG TAC GTA GCC ATC GA- 3′，下游引物序列為5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG- 3′；c- myc的上游引物序列為5′- AAACCTCCTCACAGCCCACT- 3′，下游引物序列為5′- TCCAAGACGTTGTGTGTTCG- 3′；c- fos的上游引物序列為5′- TGGACCTGTCTGGTTCCTTC- 3′，下游引物序列為5′- TGTTTAAGCTGTGCCACCTG- 3′。PCR 反應(yīng)體系25 μl，10×Buffer 2.5 μl，探針 probe 1.5 μl，dNTP 0.5 μl，H2O 20 μl，Taq 0.5 μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，70 ℃ 8 min，4 ℃保存1 h。

1.7 主動(dòng)脈組織切片的制作

各組大鼠處死后取胸主動(dòng)脈常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚3～5 μm，HE染色切片，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在顯微鏡(×400)下觀察主動(dòng)脈斑塊情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)指標(biāo)

對(duì)照組和瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Hcy顯著低于Hcy模型組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)照組與瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組血清TC、TG、LDL、Hcy差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 胸主動(dòng)脈組織病理切片

主動(dòng)脈組織病理切片用HE染色，對(duì)照組主動(dòng)脈組織內(nèi)膜完整光滑，形態(tài)正常，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，整體未見(jiàn)病理性改變；模型組主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)破壞，有纖維斑塊形成，內(nèi)有大量的泡沫細(xì)胞形成，膠原纖維組織增多。實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，管壁不光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，但是未見(jiàn)纖維斑塊的形成。見(jiàn)圖1。

組 別nHcy/μmol·L-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL/mmol·L-1對(duì)照組2023．71±1．862．91±0．361．23±0．251．82±0．25模型組2042．69±3．64ab16．90±3．52ab2．94±1．12ab22．12±4．58ab實(shí)驗(yàn)組2027．55±2．365．64±1．751．59±0．233．68±2．37F值11．0414．6010．8812．93P值0．010．010．010．01

a 與對(duì)照組比較,P<0.05;b 與實(shí)驗(yàn)組比較,P<0.05

2.3 血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

在細(xì)胞生長(zhǎng)第1天各組無(wú)顯著性差異，在第2、3、4、5天對(duì)照組與瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異，而Hcy模型組VSMC生長(zhǎng)速度顯著大于對(duì)照組和瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1大鼠主動(dòng)脈病理組織切片

圖2各組細(xì)胞生長(zhǎng)速度的比較

2.4 血管平滑肌細(xì)胞中c- myc、c- fos基因mRNA的表達(dá)

對(duì)照組和瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組c- myc和c- fos的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，Hcy模型組c- myc和c- fos的表達(dá)顯著高于正常組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

組 別c?mycc?fos對(duì)照組0．145±0．00410．158±0．0037模型組0．253±0．0029ab0．372±0．0046ab實(shí)驗(yàn)組0．171±0．00190．160±0．0018F值9．7812．31P值0．00110．0009

a 與對(duì)照組比較,P<0.05;b 與實(shí)驗(yàn)組比較,P<0.05

2.5 血管平滑肌細(xì)胞中c- myc、c- fos蛋白表達(dá)

對(duì)照組和瓜蔞皮提取物實(shí)驗(yàn)組c- myc和c- fos的蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，Hcy模型組c- myc和c- fos的表達(dá)顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3各組細(xì)胞中c-myc和c-fos蛋白表達(dá)

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是各類心血管疾病的主要病因[6]。近幾年由于人民生活水平的提高，各種心血管疾病的發(fā)病率在逐年提高，研究如何治療動(dòng)脈粥樣硬化的問(wèn)題迫在眉睫。導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的病因較多，Hcy血癥是獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。Mantjoro等研究發(fā)現(xiàn)男性血清中Hcy的濃度與心- 踝血管指數(shù)有顯著相關(guān)性，血清中Hcy濃度升高可導(dǎo)致動(dòng)脈血管壁增厚，彈性蛋白斷裂，血壓升高，最終導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[7]。臨床研究顯示高Hcy尿癥的患者易發(fā)生全身性的動(dòng)脈粥樣硬化和血栓，若體內(nèi)Hcy的濃度進(jìn)一步升高，患者死于心肌梗死和腦梗死的比例大大提升[8]，提示動(dòng)脈粥樣硬化的損傷程度與血清中Hcy的濃度有密切關(guān)系[9]。McCully等研究顯示給小鼠喂養(yǎng)高Hcy飲食可導(dǎo)致小鼠全身大、中、小動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變，最終引發(fā)小鼠各臟器(心、腦、脾、肺、腎等)的梗死[10]。本研究通過(guò)給大鼠喂養(yǎng)蛋氨酸飲食，成功誘導(dǎo)大鼠高Hcy血癥。Olszewskia研究顯示52 例40～60歲動(dòng)脈粥樣硬化的患者，其血清中Hcy水平與TG、TC濃度呈正相關(guān)[11]；動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中Hcy的升高還伴有高水平的TG、TC、LDL以及低水平的高密度脂蛋白[12]，與本研究大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型組血清結(jié)果一致，主動(dòng)脈組織病理切片進(jìn)一步證實(shí)蛋氨酸飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型成功。瓜蔞皮具有寬胸散結(jié)、清化熱痰，用于治療痰熱咳嗽、心胸悶痛[13]。近幾年研究表明瓜蔞皮提取物可抗炎癥、抗氧化，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本研究的結(jié)果證實(shí)瓜蔞皮提取物可以改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血脂水平及Hcy濃度，并且可以有效地減少動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊，說(shuō)明瓜蔞皮提取物可有效治療動(dòng)脈粥樣硬化。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的必要條件是血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖并向內(nèi)膜移行[14]。平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈中膜的主要成分，根據(jù)其功能不同分為收縮型和合成型兩種表型，在正常生理狀態(tài)下其處于非增生狀態(tài)即收縮型，當(dāng)內(nèi)膜受損時(shí)可激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，開(kāi)始迅速增殖生成泡沫細(xì)胞，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[15]。本研究中當(dāng)用Hcy處理大鼠血管平滑肌時(shí)，細(xì)胞增殖速度顯著高于對(duì)照組，證實(shí)高濃度Hcy可刺激平滑肌細(xì)胞增殖，瓜蔞皮提取物可以抑制Hcy引起的細(xì)胞增殖。說(shuō)明瓜蔞皮提取物抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的必要步驟。瓜蔞皮如何抑制高Hcy引起的細(xì)胞增殖？之前研究證明，c- myc、c- fos等基因是動(dòng)脈損傷之后的早期應(yīng)答基因[16]。c- myc蛋白是獲能因子，是DNA合成所必需的成分[17]；c- fos蛋白是一種反式調(diào)節(jié)蛋白。兩種蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)相關(guān)SMC基因開(kāi)放，產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子，促進(jìn)SMC增殖[18]。 本研究證實(shí)，高Hcy可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞c- myc、c- fos基因的表達(dá)，從而引起平滑肌細(xì)胞增殖。瓜蔞皮提取物可以抑制高Hcy引起的 c- myc、c- fos基因的表達(dá)增加，從而抑制其引起的細(xì)胞增殖。

綜上所述，瓜蔞皮提取物可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化的血脂水平，抑制高Hcy引起的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，這為動(dòng)脈粥樣硬化的治療藥物篩選提供新的思路。

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