一測(cè)多評(píng)法測(cè)定牛黃上清系列制劑中7種成分的含量

呂佳佳，王 莎，周昌艷，韋戀祝

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

牛黃上清系列制劑是中醫(yī)治療實(shí)熱證的經(jīng)典方劑，由人工牛黃、薄荷、菊花、荊芥穗、白芷、川芎、梔子、黃連、黃柏、黃芩、大黃、赤芍等19味藥材組成，具有清熱瀉火，祛風(fēng)止痛等功效[1-4]。臨床上常用于熱毒內(nèi)盛、風(fēng)火上攻所致的頭痛眩暈、目赤耳鳴、咽喉腫痛和大便燥結(jié)等。牛黃上清系列制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015版第一部[5]?，F(xiàn)行藥典僅對(duì)梔子苷、黃芩苷和大黃素進(jìn)行含量測(cè)定，由于復(fù)方中藥藥效的發(fā)揮通常是多成分共同作用的結(jié)果，決定了單一成分或少數(shù)成分難以表達(dá)整個(gè)復(fù)方的內(nèi)在質(zhì)量。因此，應(yīng)選擇多成分、多指標(biāo)進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，對(duì)與功效相關(guān)的成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本復(fù)方中川芎、當(dāng)歸、黃連、黃柏、赤芍、地黃等同為重要藥味，應(yīng)該對(duì)其主要活性成分進(jìn)行檢測(cè)，為全面控制牛黃上清系列制劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

由于多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式對(duì)對(duì)照品的種類以及數(shù)量需求較大，同時(shí)存在部分對(duì)照品不易獲得且檢測(cè)成本高等問題。王智民等[6]提出一測(cè)多評(píng)的多指標(biāo)質(zhì)控模式，在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以樣品中價(jià)廉易得的對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)，建立該成分和其他成分之間的相對(duì)校正因子，通過相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分的含量。目前已成功應(yīng)用于三七、虎杖、枳實(shí)、銀翹解毒系列制劑等的質(zhì)量控制[7～11]，且黃連藥材的一測(cè)多評(píng)法被《中國藥典》2010版收錄。因此本實(shí)驗(yàn)使用一測(cè)多評(píng)法，以梔子苷為內(nèi)參物，計(jì)算芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的相對(duì)校正因子，建立牛黃上清系列制劑的一測(cè)多評(píng)法，為其質(zhì)量控制提供新的評(píng)價(jià)模式。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 芍藥苷(批號(hào)151120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、毛蕊花糖苷(批號(hào)160526，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、阿魏酸(批號(hào)16011402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)131128，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、梔子苷(批號(hào)16121202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、黃芩苷(批號(hào)16092401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、大黃素(批號(hào)17042501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。牛黃上清片(批號(hào)20161111，密之康藥業(yè)有限公司)，牛黃上清片(批號(hào)161201，百泉制藥有限公司)，牛黃上清片(批號(hào)170146，佐今明制藥有限公司)，牛黃上清片(批號(hào)170118，巢湖今辰藥業(yè)有限公司)，牛黃上清膠囊(批號(hào)170204，天施康弋陽制藥有限公司)，牛黃上清丸(批號(hào)160132，御生堂集團(tuán)石家莊制藥有限公司)，牛黃上清丸(批號(hào)160218，中新藥業(yè)股份有限公司)，牛黃上清丸(批號(hào)16015329，同仁堂股份有限公司)。甲醇、乙睛為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent Chemstation工作站(美國Agilent公司)，Thermo Scitific Ultimate 3 000高效液相色譜系統(tǒng)，Xcalibur工作站(美國Thermo公司)，Waters 2695-2996型高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站(美國Waters公司)；色譜柱：Agilent Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Thermo Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Hedera C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BT125D型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]； DL-820D型智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；DURA12純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?～4 min，5%～20%乙腈；4～25 min，20%～40%乙腈；25～33 min，40%～85%乙腈；33～41 min，85%～5%乙腈；流速為1.0 mL/min；分段變波長測(cè)定，0～11 min為230 nm(梔子苷和芍藥苷)，11～14 min為 334 nm(毛蕊花糖苷和阿魏酸)，14～25 min為280 nm(黃芩苷和鹽酸小檗堿)，25～35 min為254 nm(大黃素)；柱溫37 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對(duì)照品的制備 精密稱取梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素對(duì)照品適量，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為梔子苷0.420 mg/mL、芍藥苷0.540 mg/mL、毛蕊花糖苷0.416 mg/mL、阿魏酸0.448 mg/mL、黃芩苷0.392 mg/mL、鹽酸小檗堿0.408 mg/mL、大黃素0.408 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。再精密吸取毛蕊花糖苷、阿魏酸、鹽酸小檗堿儲(chǔ)備液各4 mL，其余各對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得混合對(duì)照品溶液，4 ℃避光保存，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備 將牛黃上清片劑去糖衣，研細(xì)(過40目篩)，取約0.5 g，膠囊劑取10粒內(nèi)容物混勻后取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻過濾，濾液定容至50 mL容量瓶中。丸劑剪碎后，取約1.0 g，精密稱定后置圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻過濾，濾液定容至50 mL容量瓶中。

1.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按照牛黃上清片的處方比例和制備工藝，制備缺少川芎、當(dāng)歸、黃連、黃柏、赤芍、地黃藥材的陰性對(duì)照樣品溶液，并按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液、“1.3.4”項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。

1.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、7.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，在“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的峰面積，計(jì)算各組峰面積的RSD值。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取今辰藥業(yè)生產(chǎn)的牛黃上清片粉末0.5 g，平行6份，精密稱定后按“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，精密吸取各供試品溶液10 μL，依法測(cè)定，計(jì)算梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于配制后的0、4、8、12、24、36 h測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素峰面積的RSD值。

1.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的今辰牛黃上清片粉末(過40目篩)約0.5 g，平行6份，精密稱定，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，精密吸取上述供試品溶液10 μL，依法測(cè)定，計(jì)算各成分的回收率。

1.3.11 相對(duì)校正因子的確定

1.3.11.1 牛黃上清制劑中待測(cè)成分相對(duì)校正因子的計(jì)算 在牛黃上清制劑的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以制劑中梔子苷為內(nèi)標(biāo)物，建立梔子苷與芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素之間的相對(duì)校正因子，根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式 (Ck、Ak分別為內(nèi)參物對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和峰面積，Cm、Am分別為待測(cè)成分對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和峰面積)，計(jì)算梔子苷對(duì)芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素的相對(duì)校正因子。

1.3.11.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，采用Agilent 1260液相色譜系統(tǒng)，分別考察5種不同品牌的色譜柱Agilent Eclipse C18、Diamonsil Plus C18、Unitary C18、Hypersil C18、Hedera C18色譜柱；同時(shí)采用Agilent Eclipse C18色譜柱，分別考察Agilent 1260、Waters 2695-2996和Thermo Scitific Ultimate 3000 高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

1.3.12 待測(cè)組分色譜峰的定位 利用相對(duì)保留時(shí)間Rm/k進(jìn)行色譜峰定位，(m為待測(cè)組分，k為內(nèi)參物)，通過計(jì)算在不同液相色譜系統(tǒng)和不同色譜柱中各待測(cè)成分色譜峰和梔子苷色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，對(duì)各種待測(cè)成分進(jìn)行定位。

1.3.13 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法結(jié)果比較研究 為驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，考察使用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別測(cè)定牛黃上清片(密之康、百泉、佐今明、巢湖今辰藥業(yè)有限公司)，牛黃上清膠囊(天施康弋陽制藥有限公司)，牛黃上清丸(御生堂、中新、同仁堂股份有限公司)中梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn) 測(cè)得色譜圖如圖1所示，供試品溶液中各待測(cè)成分色譜峰的分離度均大于1.5，峰形良好，陰性樣品溶液在7個(gè)目標(biāo)成分的色譜峰位置均無吸收，表明方法專屬性良好。

1：梔子苷；2：芍藥苷；3：毛蕊花糖苷；4：阿魏酸；5：黃芩苷；6：鹽酸小檗堿；7：大黃素。A：對(duì)照品溶液；B：供試品溶液；C：陽性樣品溶液。圖1 4種樣品溶液的HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系的考察 將系列混合對(duì)照品溶液按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到7個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍，結(jié)果(見表1)。

表1牛黃上清系列制劑中7種成分的線性方程及范圍

成分線性方程r線性范圍(μg/mL)梔子苷Y=17.642X-8.1430.99922.520～35.280芍藥苷Y=4.719X-15.6620.99963.240～45.360毛蕊花糖苷Y=9.35X-2.4570.99913.328～46.592阿魏酸Y=7.17X-6.1120.99983.584～50.176黃芩苷Y=10.452X-8.6510.99942.352～32.928鹽酸小檗堿Y=4.274X-1.1550.99963.264～45.696大黃素Y=12.466X-3.020.99932.448～34.272

2.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)各測(cè)定結(jié)果計(jì)算梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的RSD(n=6)值。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好，同時(shí)供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，該方法的重復(fù)性良好。

表2精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%，n=6)

項(xiàng)目梔子苷芍藥苷毛蕊花糖苷阿魏酸黃芩苷鹽酸小檗堿大黃素精密度RSD0.0920.401.310.461.071.280.95重復(fù)性RSD1.751.021.032.581.410.972.83穩(wěn)定性RSD1.472.091.662.312.101.852.72

2.4 加樣回收率試驗(yàn) 將制備的加樣回收供試品溶液按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的加樣回收率分別為98.14%、96.68%、95.35%、99.24%、97.03%、101.29%、95.88%，RSD分別為1.94%、2.33%、2.09%、1.86%、2.51%、1.92%、2.75%，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 相對(duì)校正因子的確定

表3芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素的相對(duì)校正因子

進(jìn)樣體積(μL)f梔子苷/f芍藥苷f梔子苷/f毛蕊花糖苷f梔子苷/f阿魏酸f梔子苷/f黃芩苷f梔子苷/f鹽酸小檗堿f梔子苷/f大黃素31.13880.90172.75100.89222.49723.130851.13920.89262.76290.90452.58133.016371.14040.90232.72390.89292.56162.944891.15180.88312.72730.91272.52812.9691121.12590.90942.72840.88842.64623.1215151.16320.90162.73930.90352.49663.2036201.12230.91352.76760.91622.54472.9454平均值1.14030.90062.74290.90152.55083.0473RSD(%)1.241.130.651.192.063.41

2.5.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 不同色譜柱和高效液相色譜儀相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果見表4，表明各成分相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)。

表4相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

儀器色譜柱f梔子苷/f芍藥苷f梔子苷/f毛蕊花糖苷f梔子苷/f阿魏酸f梔子苷/f黃芩苷f梔子苷/f鹽酸小檗堿f梔子苷/f大黃素AgilentDiamonsilC181.16290.91722.72450.91392.54033.1474UnitaryC181.13590.89622.70450.90422.58423.1381HypersilC181.14830.92282.75880.90492.59022.9563HederaC181.15070.90392.70160.88772.62143.2047AgilentC181.13290.87962.76030.92372.50012.9198WatersAgilentC181.12140.91052.74860.91442.53242.9945DionexAgilentC181.13560.88612.72440.89832.47673.0932平均值1.14110.90232.73180.90672.54933.0649RSD(%)1.201.770.901.312.033.53

2.6 待測(cè)組分色譜峰的定位 各種待測(cè)組分色譜峰的定位結(jié)果(見表5)，表明相對(duì)保留時(shí)間的波動(dòng)較小(RSD≤5%)。

表5不同色譜儀和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

儀器色譜柱f梔子苷/f芍藥苷f梔子苷/f毛蕊花糖苷f梔子苷/f阿魏酸f梔子苷/f黃芩苷f梔子苷/f鹽酸小檗堿f梔子苷/f大黃素AgilentDiamonsilC181.17271.35041.46612.11232.15554.2632UnitaryC181.16301.32111.47351.94792.18504.1040HypersilC181.17201.31981.50041.98212.15494.1960HederaC181.14711.25551.40891.93352.27394.1744AgilentC181.14561.30641.41021.94942.21564.0459 WatersAgilentC181.13621.25561.44841.99842.26304.1593DionexAgilentC181.12521.24611.47781.95792.27114.0026平均值1.15171.29361.45501.98312.21704.1351RSD(%)1.583.152.383.082.402.18

2.7 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法結(jié)果比較研究 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定不同來源牛黃上清系列制劑中7種成分的含量比較結(jié)果(見表6)，表明兩種方法在牛黃上清系列制劑中測(cè)得各成分的含量基本一致。因此，一測(cè)多評(píng)法可以成功應(yīng)用于牛黃上清系列制劑的含量測(cè)定。

表6不同來源牛黃上清系列制劑中7種成分的含量比較(mg/g)

來源梔子苷a芍藥苷ab毛蕊花糖苷ab阿魏酸ab黃芩苷ab鹽酸小檗堿ab大黃素ab同仁堂上清丸3.8270.4270.4282.8662.8410.5060.4965.8735.6582.1682.2050.1950.187御生堂上清丸3.5190.3900.3922.6302.6070.3920.3845.4135.2141.9842.0180.1830.175中新上清丸3.8390.4310.4322.9412.9150.3850.3775.9515.7332.3372.3770.1940.185百泉上清片3.8270.4270.4292.9442.9180.3770.3705.8955.6792.1922.2290.1930.185密之康上清片3.8860.4360.4382.9752.9490.3730.3655.8305.6162.2232.2600.2030.194今辰上清片3.7480.4630.4653.0062.9800.3950.3865.9475.7292.2942.3330.2020.193佐今明上清片3.8570.4400.4422.9282.9030.4580.4495.9415.7232.2282.2660.1980.189天施康上清膠囊3.8160.4540.4562.9932.9670.3790.3715.8925.6762.1592.1960.1950.187

a為外標(biāo)法，b為一測(cè)多評(píng)法。

3 討論

牛黃上清系列制劑屬于中藥復(fù)方制劑，含有十九味中藥，成分十分復(fù)雜并且不同劑型間生產(chǎn)工藝以及輔料的不同導(dǎo)致采用一測(cè)多評(píng)法比測(cè)定單一藥材的難度大。本研究首先考察了甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸水、乙腈-0.1%磷酸水等流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)，綜合考察分離度、峰形、基線噪音等因素，結(jié)果表明，在乙腈-0.1%磷酸水的色譜條件下，牛黃上清系列制劑具有良好的色譜行為。

梔子苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素是牛黃上清系列制劑的主要活性成分，與牛黃上清系列制劑的功效具有相關(guān)性，是評(píng)價(jià)牛黃上清系列制劑質(zhì)量的適宜指標(biāo)。其中梔子苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定并且價(jià)廉易得，在制劑中含量相對(duì)較高，對(duì)照品的制備工藝也較為成熟，因此選擇其為內(nèi)參物，便于降低檢測(cè)成本。

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過查閱文獻(xiàn)初步擬定7個(gè)成分采用同一檢測(cè)波長254 nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷的靈敏度極低。為使各個(gè)成分都在其最大吸收波長下進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)混合對(duì)照品溶液中各個(gè)成分進(jìn)行紫外掃描以獲得最大吸收峰。采用分段變波長的檢測(cè)方式對(duì)7種化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合各成分出峰時(shí)間的差異，在0～11 min設(shè)定檢測(cè)波長為230 nm，以測(cè)定梔子苷和芍藥苷，11～14 min設(shè)定檢測(cè)波長為334 nm，以測(cè)定毛蕊花糖苷和阿魏酸，14～25 min設(shè)定檢測(cè)波長為280 nm，以測(cè)定黃芩苷和鹽酸小檗堿，25～35 min設(shè)定檢測(cè)波長為254 nm以測(cè)定大黃素。

文獻(xiàn)報(bào)道采用一測(cè)多評(píng)法應(yīng)滿足相對(duì)校正因子接近1 的要求，而本研究中阿魏酸、鹽酸小檗堿和大黃素的相對(duì)校正因子分別為2.74、2.55、3.05，上述3個(gè)成分的含量在外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法間的相對(duì)平均偏差分別是1.04%、0.84%、2.22%，兩種方法的含量測(cè)定結(jié)果具有相似性。結(jié)果表明相對(duì)校正因子與1相差較大時(shí)，仍可采用一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法可以成功用于藥味繁多、成分復(fù)雜、劑型工藝和輔料不同的牛黃上清系列制劑的質(zhì)量控制，為該系列制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一奠定基礎(chǔ)。

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