大黃提取物對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的保護作用研究

楊舟鑫 郭冬陽 蔡國龍

據(jù)統(tǒng)計，每年全球新增數(shù)百萬膿毒癥（sepsis）患者，其中超過1/4患者死亡[1]。膿毒癥發(fā)病與機體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)，多種因素共同導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細胞是膿毒癥發(fā)展中的重要的效應(yīng)細胞。內(nèi)皮細胞本身的損傷以及內(nèi)皮細胞功能異常，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌和血管生成素（angiopoietin，Ang）的變化，是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2-3]。中藥大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效，能夠促進胃腸蠕動、保護腸道黏膜、促進內(nèi)毒素排出、減少細菌及毒素移位及抗炎抑菌，在膿毒癥治療中可能有良好的應(yīng)用前景[4]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌表面的糖蛋白，可以被細胞表面模式識別受體識別，繼而引發(fā)多種細胞的炎癥反應(yīng)[5]，在膿毒癥的發(fā)病過程中起到了重要的作用。本研究以脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞為細胞模型，研究大黃提取物（rhubarb extract）對膿毒癥內(nèi)皮細胞的保護作用，并初步探索其中的機制。

1 實驗材料

1.1 細胞來源 臍靜脈內(nèi)皮細胞購自江陰雨汐生物科技有限公司。

1.2 藥品及試劑 大黃提取物（批號E106692）購自上海阿拉丁公司；DMEM培養(yǎng)基（批號1552510）和胎牛血清（批號10099-141）購自美國Gibco公司；脂多糖（批號L2630）為美國Sigma公司產(chǎn)品；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑（批號C0037）購自中國碧云天公司，Trizol（批號H10318）和Real-time PCR試劑盒（批號AQ131-01）為中國全式金公司產(chǎn)品，Ang1（批號 HM10638）和 Ang2（批號 HM11076）的ELISA試劑盒為中國Bio-Swamp產(chǎn)品，VEGF ELISA試劑盒（批號EHC108.48）為欣博盛公司產(chǎn)品，p65（批號 AF0874），p-p65（批號 AF2006）和 ERK 抗體（批號AF0155）為美國Affinity公司產(chǎn)品，p-ERK（批號ab214362）和β-actin（批號ab8227）為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 儀 器 CO2培養(yǎng)箱購自SANYO公司（型號XD-101），酶標儀（型號RT-6000）購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，倒置相差顯微鏡（型號IX51）購自日本OLYMPUS公司，定量PCR儀（型號X226488N） 購自德國 Eppendorf公司，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號170-4150）購自美國Bio-rad公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號G：BOXChemi XR5）購自SYNGENE公司。

2 實驗方法

2.1 臍靜脈內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng) 臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）達到80%以上時，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗，加入0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）消化約1min（37℃）。當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡觀察到細胞皺縮、彼此分離時，加入相當(dāng)于胰酶體積10%的胎牛血清終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶壁制成細胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清。加入到含 10%胎牛血清、ECGS（30μg/mL）、EGF（10ng/mL）、青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100U/mL）的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。HUVEC細胞按照1:3的比例傳代擴增。

2.2 CCK-8法細胞增殖檢測 培養(yǎng)細胞達對數(shù)生長期，細胞達到80%融合度時，用0.25%胰酶（含EDTA）消化細胞，收集細胞，1000rpm離心5min。離心后棄上層培養(yǎng)基，加入4mL新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻。細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度至1000個/100μL。取96孔板，加入細胞懸液，每孔100μL。放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜（16～24h）。LPS 處理組加入 LPS（1μg/mL），大黃提取物處理組加入LPS（1μg/mL）和大黃提取物（1、2.5、5、10、20、40μg/mL）。取出 96 孔板，棄去細胞上層培養(yǎng)基，每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基，再每孔加入 10μL CCK8，37℃孵育 4h。用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

2.3 RNA提取 HUVEC以1×105/孔的密度種于6孔板中，細胞貼壁24h后LPS處理組加入LPS（1μg/mL），大黃提取物處理組加入LPS（1μg/mL）和大黃提取物（5μg/mL）。LPS刺激的 24h后，收集細胞。加入1mL的Trizol，移入無RNA酶的EP管中，劇烈震蕩5min；加入氯仿（200μL），用力震蕩，室溫靜置 5min。12 000g 4℃離心15min，吸取無色上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置10min。12 000g 4℃離心10min，小心徹底棄去上清，加入70%的乙醇1mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管，至沉淀塊漂浮后，12 000g 4℃離心5min，小心棄去乙醇。室溫晾干沉淀2～5min，加入20μL RNA溶解液溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀后，放冰上溶解30min左右。

2.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄 按說明書配置20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為42℃，30min。配置20μL熒光定量PCR反應(yīng)體系，使用55℃的退火溫度反應(yīng)40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，分析目的基因的相對表達量。擴增產(chǎn)物的特異性通過繪制融解曲線來進行驗證。用于實時定量PCR的引物如下：Ang1正向引物：5’-AGCTGACAGATGTTGAGACC-3’;Ang1 反向引物：5’-GTCCAACTCTTCCTTGTGTT-3’;Ang2 正向引物：5’-TAGACAAGCTGCGTAGAGAG-3’;Ang2反向引物：5’-GTCTGTGGCTGAGATGAACT-3’;β-actin 正向引物：5’-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3’;β-actin 反向引物：5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3’。

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）檢測蛋白表達 ERK、p-ERK、p65和p-p65蛋白的變化通過WB法檢測。主要步驟如下：細胞處理方法同2.3。使用細胞裂解液裂解細胞，4℃下12 000rpm離心15min，將離心后的上清加入上樣緩沖液，混合后于100℃處理5min，每孔上樣100μg細胞總蛋白，在電泳槽電泳。將膠小心地鋪在濾紙上，表面再覆蓋大小合適的聚偏二氟乙烯膜，后再覆蓋兩層濕潤濾紙，在轉(zhuǎn)膜槽轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜過程在4℃進行，采用100V/100mA。采用封閉液封閉；封閉時間為室溫下2h，在搖床上進行。在一個5mL的EP管中加入2mL的封閉液，再加入適量的一抗，置于4℃冰箱中過夜。一抗比例1:5000。將過夜雜交的膜從塑料袋中取出，投入含有足量體積緩沖液的洗膜盒中，于搖床上清洗，每次10min，連續(xù)3次。處理步驟類似一抗雜交步驟，不同之處在于二抗雜交可在常溫下，1h內(nèi)完成。二抗比例1:5000。將過夜雜交的膜從塑料袋中取出，投入含有足量緩沖液的洗膜盒中，于搖床上清洗，每次10min，連續(xù)3次。將膜平放于干燥的平面上，將新鮮配置好的化學(xué)發(fā)光試劑滴加到有鉛筆記號標注的膜面上，反應(yīng)5min后用濾紙在膜的邊緣盡量吸去多余的化學(xué)發(fā)光試劑，將膜放到暗盒中收集信號。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Ang1、Ang2和VEGF的濃度 吸取用于提取2.3或2.5的細胞培養(yǎng)上清，凍存于-80℃冰箱。簡要操作步驟如下：在酶標包被板上設(shè)標準品孔，依次加入說明書中規(guī)定的濃度的標準品50μL。分別設(shè)空白孔和待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加入樣品40μL，然后再加生物素標記的抗體10μL。用封板膜封板后置于37℃溫育30min。棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去,如此反復(fù)5次，拍干。每孔加酶標試劑50μL，空白孔除外。溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑A 50μL，然后加入顯色劑B 50μL，輕輕混勻，37℃避光顯色15min。每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)為單次實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s） 表示，應(yīng)用prism5.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 大黃素保護脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活力下降向臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)體系中加入1μg/mL的LPS可以降低臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖（P＜0.01）。與LPS刺激組比較，5μg/mL以上的大黃提取物對HUVEC增殖的保護作用均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)大黃提取物濃度達到5μg/mL時，細胞的增殖率趨于平穩(wěn)。5、10、20、40μg/mL 大黃提取物組間吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。據(jù)此確定本實驗使用的大黃提取物濃度為5μg/mL。見表1。

表1 各組HUVEC細胞體外增殖比較

3.2 大黃提取物調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)VEGF 脂多糖可上調(diào)HUVEC的VEGF分泌（P＜0.01）；加入大黃提取物（5μg/mL）后，VEGF分泌相對于LPS誘導(dǎo)后有明顯下降（P＜0.01），見表 2。

表2 各組HUVEC細胞VEGF、Ang1和Ang2分泌比較（pg/mL）

3.3 大黃提取物調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)HUVEC分泌Ang1/2作用 脂多糖處理后，HUVEC的Ang1分泌減少，Ang2分泌增加（P＜0.01）；LPS誘導(dǎo)的 HUVEC經(jīng)大黃提取物（5μg/mL）處理后，Ang1分泌增加（P＜0.05），Ang2分泌減少（P＜0.05）。定量 PCR 結(jié)果也顯示，大黃提取物上調(diào)Ang1基因表達（P＜0.01），下調(diào)Ang2基因表達（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組HUVEC細胞Ang1和Ang2 mRNA表達比較

3.4 大黃提取物對脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC ERK和p65磷酸化調(diào)節(jié)作用 大黃提取物（5μg/mL）處理后未檢測到ERK明顯變化，但p-ERK明顯下降。同樣p65變化不大，而p-p65明顯下降。說明大黃提取物明顯降低NF-κB信號通路和ERK信號通路的活化，見圖1。

4 討論

在脂多糖處理后，臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖下降，分泌 VEGF 增加，下調(diào) Ang1 并上調(diào) Ang2（P＜0.01），這些變化與膿毒癥發(fā)病過程中類似。而使用大黃提取物處理后，HUVEC的增殖能力有所恢復(fù)，同時VEGF分泌下降，Ang1上升且 Ang2下降（P＜0.05，P＜0.01）。同時NF-κB信號通路和ERK信號通路的激活也可以被大黃提取物所抑制。這些結(jié)果提示，大黃提取物可以保護膿毒癥內(nèi)皮細胞。

大黃提取物對內(nèi)皮細胞活力保護，提示其可以促進膿毒癥中內(nèi)皮細胞的存活，保護膿毒癥內(nèi)皮的完整性。VEGF是內(nèi)皮細胞通透性的關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子[6]，因此大黃提取物下調(diào)HUVEC分泌VEGF的作用，則與膿毒癥內(nèi)皮細胞通透性保護密切相關(guān)。因此大黃可以從促進內(nèi)皮細胞存活和維持內(nèi)皮通透性兩個方面保護內(nèi)皮細胞。

血管生成素平衡的破壞是膿毒癥內(nèi)皮損傷的重要因素[2]。Ang1可以和內(nèi)皮細胞膜上的Tie2受體特異性結(jié)合，引起其受體磷酸化和隨后的信號傳遞。Ang1可以抑制內(nèi)皮細胞凋亡、促進內(nèi)皮細胞生存，并可以穩(wěn)定血管，防止?jié)B漏；而Ang2的主要功能是競爭性抑制Ang1形成不穩(wěn)定的血管[7]。因此大黃上調(diào)Ang1，抑制Ang2的作用可以保護血管，可能在膿毒癥內(nèi)皮保護中起到重要作用。

NF-κB和ERK信號通路對于膿毒癥發(fā)生發(fā)展具有重要意義。在LPS等刺激下，p65和ERK發(fā)生磷酸化，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核，從而啟動炎性細胞因子、炎性因子、趨化因子等基因轉(zhuǎn)錄[8-9]。NF-κB p65和ERK可以調(diào)控細胞活力、VEGF分泌和Ang1/2平衡[10-11]，因此大黃提取物對膿毒癥內(nèi)皮細胞的保護作用可能是作用于NF-κB和ERK信號通路實現(xiàn)。

總之，大黃提取物可以保護LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞存活，抑制VEGF分泌，維持Ang1/2的平衡。這些保護作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB和ERK信號通路實現(xiàn)。本項研究的結(jié)果提示，大黃可以保護膿毒癥內(nèi)皮穩(wěn)定性，為大黃提取物在膿毒癥的應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

圖1 大黃提取物抑制脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC的ERK和p65磷酸化（A：LPS+HUVEC；B：LPS+HUVEC+大黃提取物）

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