共培養(yǎng)杜英葉片內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

呂朦朦 譚明慧 路莉文 包尚松 郭志勇 鄧張雙 鄒 坤

(1. 三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002; 2. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

植物內(nèi)生菌是指其生活史或者部分生活史寄生于植物體內(nèi)不引起植物病害癥狀的一大類微生物的總稱[1]．有證據(jù)表明從植物在地球上出現(xiàn)時(shí)，微生物就已經(jīng)寄生于其中[2]，經(jīng)過約25億年的進(jìn)化，植物與微生物之間早已形成穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系，有的甚至進(jìn)化出特有專一性寄生[3]．近年來，植物內(nèi)生真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究成為天然藥物化學(xué)的研究熱點(diǎn)，大量具有各種生物活性同時(shí)擁有新穎結(jié)構(gòu)的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物被報(bào)道[4]．在植物內(nèi)生真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中，經(jīng)典方法是在實(shí)驗(yàn)室條件下單一菌株的純培養(yǎng)，即把植物組織中的能分離純化的內(nèi)生真菌一一分離純化，然后篩選合適的培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)來尋找新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物．在這些研究中存在如下問題，首先，只有少數(shù)內(nèi)生真菌能在普通培養(yǎng)基中生長，而大部分內(nèi)生菌無法純化得到單一菌株；其次，純培養(yǎng)不能反映植物內(nèi)生真菌原始的共存狀態(tài)，內(nèi)生菌群在植物受到病害入侵或者環(huán)境巨變時(shí)，內(nèi)生菌群會(huì)產(chǎn)生特殊的次級(jí)代謝產(chǎn)物來應(yīng)對(duì)這些變化，純培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物不是植物內(nèi)生菌發(fā)揮生態(tài)作用的“原始代謝產(chǎn)物”；最后，植物組織和成分還能給其內(nèi)生菌提供特定營養(yǎng)因子或者固體支撐，在純培養(yǎng)中沒有體現(xiàn)植物的作用．為解決上述存在的問題同時(shí)探究內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物在植物組織內(nèi)的生態(tài)作用及模擬植物內(nèi)生菌的生存環(huán)境，本文采用植物組織共培養(yǎng)的方法來研究植物內(nèi)生菌．

杜英(ElaeocarpusdecipiensHemsl.),杜英科，杜英屬，俗稱杜栗，常綠喬木．原產(chǎn)我國長江流域和南亞熱帶地區(qū)，日本也有分布,多生于海拔400～1 200 m的丘陵山地[5]，常用于綠化植物，在其生長周期中病害，蟲害非常少．因而推測(cè)其內(nèi)生菌可能在其抵御病蟲害的過程中扮演著重要作用，因此采用共培養(yǎng)的方法從杜英葉片內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到7個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，運(yùn)用核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)等光譜學(xué)方法鑒定,分別為daldinone A(1), alternariol(2), 4-methylalternariol(3), alternuene(4),(E)-3-benzylidene-2-Methylhexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione(5),(Z)-3-benzylidene-2-methylhexa-hydropyrrolo[1,2-a] pyrazine-1,4-dione(6)及甘油三醋酸酯(7)．

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器與試劑

Bruker 400 核磁共振波譜儀(瑞士); Dionex U3000二極管陣列檢測(cè)器DAD分析型高效液相色譜儀(美國)和Waters 1525型雙通道紫外檢測(cè)器半制備型高效液相色譜儀(美國); Thermofisher EI質(zhì)譜儀(美國)；Chirascan qCD圓二色譜儀(英國)；X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)(北京泰克儀器有限公司)；AL204電子天平(METTLWRTOLEDO);色譜柱Kromasil分析型(250 mm×4.6 mm，5 μm)，半制備型Kromasil(250 mm×4.6 mm，10 μm)，N21001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)等;柱層析和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其它溶劑均為分析純，經(jīng)過常壓蒸餾純化后使用．

2.2 植物內(nèi)生菌的共培養(yǎng)

植物樣品杜英葉片采自三峽大學(xué)校園內(nèi)，杜英葉片在超凈臺(tái)上依次以5%～10% NaClO消毒5 min，75%的乙醇消毒2 min，最后以無菌水洗滌3次，以無菌濾紙吸附葉片表面的無菌水，以無菌的剪刀剪成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，直接置于消毒后的固體培養(yǎng)基上．固體培養(yǎng)基中含140 g大米，70 g的麥麩皮，加入250 mL自來水，置于3 L的三角瓶中，經(jīng)121℃(0.1 MPa)高溫滅菌30 min后使用．在超凈工作臺(tái)上接入表面消毒后的杜英植物組織，共接種10瓶，于室溫中靜置培養(yǎng)40 d．

2.3 提取與分離

待真菌菌絲長滿培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)瓶中搗碎固體培養(yǎng)基，以乙酸乙酯浸提，置于超聲波下重復(fù)提取3次，每次2 h，合并萃取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得浸膏25 g，樣品溶于甲醇中，以正己烷脫脂，得脫脂后樣品20 g，取其中18 g樣品，經(jīng)200～300目硅膠拌樣，正相硅膠柱層析，依次以石油醚-乙酸乙酯[95/5、90/10、85/15、80/20、75/25、70/30、65/35、60/40、55/45、50/50(v/v)]梯度洗脫得到10個(gè)組分Fr.1-Fr.10，各組分經(jīng)薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)分析后，選取其中4個(gè)組分(Fr.3-Fr.6)分離純化．Fr.3經(jīng)正相硅膠柱層析[石油醚/丙酮=80/20(v/v)，洗脫]，液相半制備柱[水/乙腈=35/65(v/v)，2 ml/min]分離得到化合物1(tR=22.7 min, 46 mg)，F(xiàn)r.4經(jīng)正相硅膠柱層析[石油醚/丙酮=90/10(v/v)，洗脫]，Sephadex LH-20層析[二氯甲烷/甲醇=50/50(v/v)，洗脫]，得到化合物2(87 mg)和化合物3(45 mg); Fr.5經(jīng)正相硅膠柱層析[石油醚/乙酸乙酯=85/15(v/v)，洗脫]，液相半制備柱[水/乙腈=25/75(v/v)，2 ml/min]得到化合物4(tR=17.4 min,10 mg)，化合物5(tR=22.5 min, 8 mg),化合物6(tR=24.1 min, 11 mg);Fr.6經(jīng)過正相硅膠柱層析[石油醚/乙酸乙酯=75/25(v/v)，洗脫],Sephadex LH-20層析[二氯甲烷/甲醇=50/50(v/v)，洗脫]，得到化合物7(10 mg)．化合物1-7的結(jié)構(gòu)如圖1所示．

圖1 化合物1-7的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)果與討論

化合物1，無色油狀物，EI-MS得分子離子峰(m/z)366，其一維氫譜在δ 6.8-7.77之間顯示5個(gè)芳香質(zhì)子，分別位于δ 6.80(d, 9.1, 1H), 6.83(d, 9.1, 1H), 7.10(d, 7.4, 1H), 7.43(t, 8.2, 1H), 7.77(d, 8.5, 1H), 根據(jù)耦合常數(shù)推斷化合物1中存在1個(gè)1, 2, 3-三取代的苯環(huán)和1個(gè)1, 2, 3, 4-四取代苯環(huán)；在低場(chǎng)有2組尖銳的質(zhì)子信號(hào)分別位于δ 10.87和12.28，顯然是α，β不飽和酮羰基與其γ-位的酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵的活潑氫信號(hào)；剩余的氫信號(hào)分布于δ 1.74-3.23之間．一維碳譜顯示20個(gè)碳信號(hào)包括2個(gè)酮羰基信號(hào)，分別位于δ 203.1 和202.8處，位于δ 113.9-161.4的12個(gè)碳信號(hào)顯然是2個(gè)苯環(huán)上芳香碳信號(hào)，1個(gè)連氧季碳位于δ 79.7處，剩余的碳信號(hào)分別位于δ 55.6, 41.4, 37.8, 35.6, 28.1處，通過DEPT判斷δ 55.6, 41.4,為次甲基，而δ37.8, 35.6, 28.1為3個(gè)亞甲基．通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物1與daldinone A的波譜數(shù)據(jù)一致[6]，因而化合物1的結(jié)構(gòu)確定為daldinone A(如圖1所示)．

化合物1的波譜數(shù)據(jù)：13NMR(100 MHz, CDCl3): δ 203.1(C), 202.8(C), 161.4(C), 160.6(C), 148.7(C), 143.3(C), 137.4(CH), 136.9(C), 131.1(CH), 119.7(CH), 117.3(CH), 116.6(CH), 115.2(C), 113.9(C), 79.7(C), 55.6(CH), 41.4(CH), 37.8(CH2), 35.6(CH2), 28.1(CH2);1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 12.28(s, 1H), 10.87(s, 1H), 7.77(d, 8.5, 1H), 7.43(t, 8.12, 1H), 7.10(d, 7.4, 1H), 6.83(d, 9.1, 1H), 6.80(d, 9.1, 1H), 3.23(dd, 5.85, 17.6, H), 2.86(dd, 1.8, 17.6, 2H), 2.74(td, 4.6, 11.2, 1H), 2.63(m, 1H), 2 .57(m, 1H), 2.51(dd, 4.6, 13.2, 1H), 2.37(m, 1H), 1.74(dddd, 3.96, 13.2, 1H)．

化合物2，淡黃色無定型固體，mp. 345～347 ℃，EI-MS得分子離子峰(m/z) 258．其一維氫譜很簡單，僅有四組苯環(huán)上處于間位的芳香氫信號(hào)δ 7.21(d, 1.2, 1H), 6.70(d, 2.4, 1H), 6.62(d, 2.4, 1H), 6.34(d, 1.2, 1H)，而剩余的氫信號(hào)位于δ 11.8(br s, 1H) 和2.68(s, 3H) 處, 通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物2與alternariol的波譜數(shù)據(jù)一致[7]，因而確定化合物2為alternariol．化合物2的NMR數(shù)據(jù)：13C NMR(100 MHz, DMSO-d6): δ 166.0(C), 164.8(C), 164.0(C), 158.4(C), 152.6(C), 138.3(CH), 138.0(C), 117.5(CH), 109.0(C), 104.5(CH), 101.6(CH), 100.9(C), 97.1(C), 25.2(CH3);1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 11.8(br s, 1H), 7.21(d, 1.2, 1H), 6.70(d, 2.4, 1H), 6.62(d, 2.4, 1H), 6.34(d, 1.2, 1H), 2.68(s, 3H)．

化合物3，淡黃色無定型固體，mp. 297～299℃，EI-MS得分子離子峰(m/z) 272．化合物3與化合物2的波譜數(shù)據(jù)非常類似，在一維氫譜上僅僅是多1個(gè)甲氧基信號(hào)δ 3.89(s, 3H), 通過與文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)化合物3與4-methylalternariol的波譜數(shù)據(jù)一致[8]，因而確定化合物3為4-methylalternariol．化合物3的波譜數(shù)據(jù)：13C NMR(100 MHz, DMSO-d6): δ 166.2(C), 164.7(C), 164.2(C), 158.6(C), 152.7(C), 138.5(CH), 137.8(C), 117.6(CH), 108.8(C), 103.4(C), 101.7(CH), 99.2(C), 98.5(C),55.9(CH3), 25.1(CH3);1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 11.8(br s, 1H), 7.18(d, 1.6, 1H), 6.70(d, 2.4, 1H), 6.62(d, 2.4, 1H), 6.34(d, 1.6, 1H), 3.89(s, 3H), 2.71(s, 3H)．

化合物 4，無色油狀物，EI-MS得分子離子峰(m/z) 292，其一維氫譜顯示3組烯氫信號(hào)，位于δ 6.51(d, 1.6, 1H), 6.43(d, 1.6, 1H), 6.12(s, 1H), 還有2組連氧碳上的氫信號(hào)δ 4.17(d, 6.4, 1H), 3.85(s, 1H), 其余的氫信號(hào)處于δ 2.57(dd, 3.6, 14.8, 1H), 1.86(dd, 3.6, 14.8, 1H), 1.32(s, 1H), 1.28(m, 1H) 處．通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物4與alternuene 一致[9]． 化合物4的波譜數(shù)據(jù)：13NMR(100 MHz, CDCl3): δ 168.9(C), 166.2(C), 164.1(C), 138.9(C), 133.8(CH), 130.0(CH), 103.0(CH), 100.7(CH), 100.6(C), 81.1(C), 72.9(CH), 70.2(CH), 55.7(CH3), 40.7(CH2), 28.0(CH3);1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 11.2(br s, 1H), 6.51(d, 1.6, 1H), 6.43(d, 1.6, 1H), 6.12(s, 1H), 4.17(d, 6.4, 1H), 3.85(s, 1H), 2.57(dd, 3.6, 14.8, 1H), 1.86(dd, 3.6, 14.8, 1H), 1.32(s, 1H), 1.28(m, 1H)．

化合物5，為無色油狀物，EI-MS得分子離子峰(m/z) 256，其一維氫譜和碳譜較為簡單，在其一維氫譜中，顯示3組芳香氫信號(hào)分別位于δ 7.36(m, 2H)，7.31(m, 3H)，7.15(s, 1H)，其中位于δ 7.36(m, 2H)，7.31(m, 3H)的氫信號(hào)顯然是單取代苯環(huán)的特征，表明化合物5中可能存在1個(gè)單取代苯環(huán)；其余的氫信號(hào)均處于高場(chǎng)區(qū)，其中位于δ 2.88(s, 3H)的單峰甲基信號(hào)，可能為氮原子上的甲基信號(hào)；其一維碳譜顯示化合物5中僅有13個(gè)碳信號(hào)，其中δ 167.9，161.4的碳信號(hào)可能為羰基碳信號(hào)，綜合分析化合物5的一維譜推斷該化合物可能為環(huán)肽類化合物，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物5與(E)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione 的波譜數(shù)據(jù)一致[10]，因而化合物5確定為(E)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo[1,2-a] pyrazine-1,4-dione．

化合物5的波譜數(shù)據(jù)：13NMR(100 MHz, CD3COCD3-d6): δ 168.7(C), 161.3(C), 135.7(C), 135.3(C), 130.5(CH), 129.3(CH) , 129.1(CH), 119.7(CH), 59.3(CH), 45.8(CH2), 34.8(CH3), 28.8(CH2), 23.4(CH2);1H NMR(400 MHz, CD3COCD3-d6): δ 7.36(m, 2H), 7.31(m, 3H), 7.15(s, 1H), 4.25(dd, 2.4, 15.6, 1H), 3.66(m, 2H), 2.88(s, 3H), 2.41(m, 1H), 2.21(m, 1H), 2.08(m, 1H), 1.96(m, 1H)．

化合物6，為無色油狀物，EI-MS得分子離子峰(m/z) 256，其一維氫譜和碳譜與化合物5的氫譜和碳譜幾乎完全一樣，但是在HPLC上顯示是明顯的2個(gè)峰，仔細(xì)分析化合物5的NMR圖譜和結(jié)構(gòu)，化合物5能夠變化的位置只有雙鍵構(gòu)型順反的變化，因而推測(cè)化合物6的雙鍵為順式構(gòu)型即與化合物5的雙鍵構(gòu)型相反．為了證實(shí)這種推斷，進(jìn)一步分析化合物5和6的NOESY譜，發(fā)現(xiàn)化合物6的單峰芳香氫與甲基的相關(guān)信號(hào)峰消失了，NOESY實(shí)驗(yàn)都是在相同的條件下進(jìn)行，因而我們推測(cè)化合物6為化合物5的順式異構(gòu)體．化合物6為首次從自然界中分離得到．

化合物6的波譜數(shù)據(jù)：13NMR(100 MHz, CD3COCD3-d6): δ 167.9(C), 161.4(C), 135.1(C), 134.7(C), 129.9(CH), 128.8(CH), 128.5(CH), 119.2(CH), 58.8(CH), 45.2(CH2), 34.2(CH3), 28.0(CH2), 22.8(CH2);1H NMR(400 MHz, CD3COCD3-d6): δ 7.36(m, 2H), 7.31(m, 3H), 7.15(s, 1H), 4.25(dd, 2.4, 15.6, 1H), 3.66(m, 2H), 2.88(s, 3H), 2.41(m, 1H), 2.21(m, 1H), 2.08(m, 1H), 1.96(m, 1H)．

化合物7，為無色油狀物，其一維氫譜和碳譜非常簡單．在其一維氫譜中，僅僅只有5組峰，分別位于δ 5.25, 4.29, 4.15, 2.09, 2.08處，其碳譜更簡單，分別位于δ 170.5, 170.1, 69.1, 62.3, 20.9和20.8處，在一維碳譜中δ 170.5的碳信號(hào)比 170.1的碳信號(hào)，δ 62.3的碳信號(hào)比69.1的碳信號(hào), δ 20.7的碳信號(hào)比20.9的碳信號(hào)明顯高很多，因而推斷δ 170.5，62.3，20.7的碳信號(hào)代表的是2個(gè)碳信號(hào)．結(jié)合上述的一維碳譜和氫譜的分析結(jié)合查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，化合物7是三乙?；母视蚚11]．化合物7的波譜數(shù)據(jù)：13NMR(100 MHz,CD3OD-d4): δ 170.5(C), 170.1(C)，69.1(CH), 62.3(CH2), 20.9(CH3), 20.7(CH3);1H NMR(400 MHz, CD3OD-d4): δ 5.25(m, 1H), 4.29(dd, 4.4, 12.0, 2H), 4.15(dd, 4.2, 12.0, 2H), 2.09(s, 3H), 2.08(s, 6H)．

4 結(jié) 論

采用共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)杜英葉片內(nèi)生菌，并通過柱層析，凝膠色譜，半制備液相色譜等技術(shù)對(duì)其共培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化，共獲得7個(gè)化合物，通過核磁共振，質(zhì)譜等方法確定其結(jié)構(gòu)，分別為daldinone A (1)，alternariol(2), 4-methylalternariol(3), alternuene(4),(E)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione(5),(Z)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo[1,2-a] pyrazine-1, 4-dione(6), 甘油三醋酸酯(7)．化合物1-7是首次從杜英的內(nèi)生菌中獲得，化合物6首次從自然界中分離得到．化合物1是一個(gè)以少見的稠合方式形成的一個(gè)二聚體類的聚酮化合物，是在自然界中第二次從植物內(nèi)生菌中分離得到，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道化合物1對(duì)真菌有一定的抑制作用[12]，而化合物2 -4為鏈格孢酚類的真菌毒素，該類化合物廣泛存在于Fusaium sp.類真菌中，化合物1-4為共培養(yǎng)杜英葉片內(nèi)生菌的主要代謝產(chǎn)物，量相對(duì)其它類化合物較多，可能是植物杜英抵抗其病蟲害的“生態(tài)武器”，在后期的后續(xù)研究中還需要進(jìn)一步確認(rèn)上述4種次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)杜英的生態(tài)保護(hù)作用．同時(shí)還需要通過與經(jīng)典方法純培養(yǎng)比較，并分析兩者之間的代謝產(chǎn)物的差別，從而明確杜英與其內(nèi)生真菌之間的生態(tài)依存關(guān)系．

目前，對(duì)內(nèi)生菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究主要集中在單一菌株純培養(yǎng)及2-3種菌株之間的共培養(yǎng)，而多菌株的共培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)更多應(yīng)用于傳統(tǒng)食品的制作，如醋，黃酒釀造等[13]，但是多菌株之間相互作用關(guān)系及對(duì)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的影響正成為新的研究熱點(diǎn)．本文采用共培養(yǎng)植物組織內(nèi)生菌的技術(shù)誘導(dǎo)內(nèi)生菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)挖掘提高內(nèi)生菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力具有探索意義．

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