順鉑聯(lián)合香菇多糖對肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者胸水調(diào)節(jié)性T細胞的影響及意義

葉茂 周毅

順鉑聯(lián)合香菇多糖對肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者胸水調(diào)節(jié)性T細胞的影響及意義

葉茂 周毅

目的 分析肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者胸腔內(nèi)注入順鉑聯(lián)合香菇多糖前后胸水調(diào)節(jié)性T細胞（CD4C+D25C+D127low）及CD4C+D25C+D127high的改變，探討香菇多糖聯(lián)合順鉑胸腔內(nèi)注射治療肺癌并發(fā)惡性胸腔積液局部胸腔微環(huán)境的免疫功能改變。方法選取肺癌并發(fā)胸水患者60例（觀察組和對照組各30例）。對照組給予順鉑50mg（體重＞50kg）或40mg（體重＜50kg）胸腔內(nèi)注射治療，觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上加用香菇多糖（4mg）。兩組患者分別于給藥前及給藥后第7、14天抽取胸水檢測CD4C+D25C+D127low及CD4C+D25C+D127high。結(jié)果觀察組總緩解率明顯高于對照組（P＜0．05），不良反應(yīng)發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。給藥前及給藥后第7天，兩組患者CD4+CD25+CD127low/CD4及CD4+CD25+CD127high/CD4的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0．05）；給藥后第14天，觀察組CD4+CD25+CD127low/CD4明顯低于對照組，CD4+CD25+CD127high/CD4明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。與給藥前比較，給藥后第7、14天CD4+CD25+CD127low/CD4均明顯降低，CD4+CD25+CD127high/CD4均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05或0．01）。結(jié)論胸腔內(nèi)注入順鉑聯(lián)合香菇多糖能影響肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者胸水中調(diào)節(jié)性T細胞的水平，可能對胸腔內(nèi)微環(huán)境的免疫功能改變有一定的優(yōu)化作用。

肺癌 胸腔積液 順鉑 香菇多糖 調(diào)節(jié)性T細胞

惡性胸腔積液是肺癌晚期并發(fā)癥之一。胸腔內(nèi)局部注射順鉑是惡性胸腔積液的常見治療手段。香菇多糖是一種從香菇實體中提取的多糖，具有增強機體免疫功能、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用，近年的研究表明香菇多糖能顯著延長晚期腫瘤患者的生存期，提高生活質(zhì)量，被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療[1]。本研究通過研究香菇多糖聯(lián)合順鉑胸腔內(nèi)注射治療肺癌并發(fā)惡性胸腔積液的療效及治療前后胸水CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的變化，以期了解香菇多糖聯(lián)合順鉑胸腔內(nèi)注射治療肺癌并發(fā)惡性胸腔積液的免疫機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2009-05—2013-05我科收治的肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者60例，Kamofsky評分＞60分，預(yù)計生存期＞3個月。根據(jù)不同時期治療方法的不同分為兩組，其中觀察組30例，男21例，女9例；年齡38～72（55.83±15.72）歲；明確診斷為肺鱗癌并胸膜轉(zhuǎn)移5例，肺腺癌并胸膜轉(zhuǎn)移14例，小細胞肺癌9例，未能明確具體病理類型但CT診斷為肺癌且胸水中找到腫瘤細胞共2例。對照組30例，男19例，女11例；年齡40～73（54.98± 14.87）歲；明確診斷為肺鱗癌并胸膜轉(zhuǎn)移4例，肺腺癌并胸膜轉(zhuǎn)移16例，小細胞肺癌7例，未能明確具體病理類型但CT診斷為肺癌且胸水中找到腫瘤細胞共3例。兩組患者性別、年齡及病理類型的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。治療前均行血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、心電圖檢查無明顯異常。無化療禁忌并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者均在B超定位下行胸腔穿刺術(shù)。選擇B超顯示的最佳穿刺處進針，置入中心靜脈導(dǎo)管，連接引流袋，行胸腔閉式引流。對照組采用順鉑50mg（體重＞50kg）或40mg（體重＜50kg）胸腔內(nèi)注射治療。觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上加用香菇多糖4mg胸腔內(nèi)注射治療。1周后仍存留胸水（抽液量＞100ml）患者繼續(xù)注入上述藥物。每次給藥前抽盡積液。每次給藥后2h內(nèi)不斷變換體位，使藥物均勻分布。兩組患者均于給藥前及給藥后第7、14天抽液監(jiān)測胸水調(diào)節(jié)性T細胞3次。第14天抽盡液體后拔管出院隨訪。所有患者均使用水化及止吐藥，治療期間停用其他化療藥及免疫調(diào)節(jié)劑。每周復(fù)查血常規(guī)、心電圖、肝功能、腎功能、胸部B超，詳細記錄用藥后患者反應(yīng)。4周后評價療效。

1.2.2 檢查方法 將收集的20ml胸水離心，棄上清液，留取沉淀細胞并打散，加入PBS，再反復(fù)洗滌3次，制成細胞懸液，采用三色直接免疫熒光標記法檢測。用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD25單抗、藻紅蛋白（PE）標記的CD127單抗和PE-Cy-CD4同型陰性對照劑檢測胸水調(diào)節(jié)性T細胞。首先在試管中加入胸水100μl，然后分別加入CD25-FITC、CD127-PE及CD4-PC5-Cy5單抗各10μl，充分混勻后室溫下避光孵育15min，加入1ml溶血劑，37℃水浴箱放置10min，待完全溶血時立即上流式細胞儀檢測。

1.3 療效評價 按照WHO標準分為：完全緩解：胸腔積液完全消失且維持4周以上；部分緩解：胸腔積液減少＞1/2且維持4周以上；無效：胸腔積液減少＜1/2或增加。以（完全緩解+部分緩解）/總例數(shù)×100%為總有效率。不良反應(yīng)按WHO統(tǒng)一標準進行評價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者近期治療情況的比較 觀察組完全緩解11例，部分緩解13例，總緩解率為80.0%；對照組完全緩解6例，部分緩解10例，總緩解率為53.3%。觀察組總緩解率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組出現(xiàn)惡心、嘔吐Ⅰ度3例，Ⅰ度骨髓抑制2例，Ⅱ度骨髓抑制1例，輕度胸痛2例，不良反應(yīng)發(fā)生率為26.7%；對照組出現(xiàn)惡心、嘔吐Ⅰ度3例，惡心、嘔吐Ⅱ度1例，Ⅱ度骨髓抑制2例，輕度胸痛3例，不良反應(yīng)發(fā)生率為30.0%。兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組患者治療前后調(diào)節(jié)性T細胞水平的比較 見表1。

表1 兩組患者治療前后調(diào)節(jié)性T細胞水平的比較

由表1可見，給藥前及給藥后第7天，兩組患者CD4+CD25+CD127low/CD4及CD4+CD25+CD127high/CD4的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；給藥后第14天，觀察組CD4+CD25+CD127low/CD4明顯低于對照組，CD4+CD25+CD127high/CD4明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 觀察組中治療有效的24例患者治療前后調(diào)節(jié)性T細胞水平的比較 見表2。由表2可見，與給藥前比較，給藥后第7、14天CD4+CD25+CD127low/CD4均明顯降低，CD4+CD25+CD127high/ CD4均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表2 觀察組中治療有效的24例患者治療前后調(diào)節(jié)性T細胞水平的比較

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體對其免疫監(jiān)視始終處于動態(tài)改變中。目前，腫瘤免疫逃逸是影響腫瘤免疫治療的主要原因。Sakaguchi等[2]首次報道調(diào)節(jié)性T細胞后引起臨床廣泛關(guān)注，其可以抑制識別自身腫瘤細胞的效應(yīng)細胞的發(fā)育和活化，在介導(dǎo)機體腫瘤免疫耐受中起著重要的作用。

順鉑是一種廣譜周期非特異性抗腫瘤藥物，主要是通過與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，阻止其復(fù)制而殺死各期腫瘤細胞。經(jīng)胸腔注入順鉑后，順鉑在胸腔積液中的濃度比血漿中高40倍以上，可直接對腫瘤細胞產(chǎn)生強大的殺傷作用。香菇多糖是從香菇子實體提取的一種高分子葡聚糖，屬于新型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[3]。動物實驗表明，香菇多糖能夠提高機體的特異性、非特異性免疫功能，能夠刺激人體淋巴細胞的增殖，刺激抗體形成及免疫應(yīng)答，通過免疫增強作用間接起到抗腫瘤作用。陳志和等[4]在對香菇多糖治療晚期腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，香菇多糖不但能夠提高化療療效，改善機體的免疫功能，起到抗腫瘤的作用，同時也能降低化療藥物對機體的毒副反應(yīng)，與化療聯(lián)合應(yīng)用能改變抗癌藥的化學(xué)敏感性，有效控制惡性胸水的滲出，促進淋巴液回流，改善患者營養(yǎng)狀況，有協(xié)同增效作用。

傳統(tǒng)觀念認為，腫瘤患者在化療后免疫細胞數(shù)量減少，免疫功能相對低下。近年來越來越多的研究認為，化療雖然抑制了免疫系統(tǒng)，但在淋巴細胞減少的情況下，能使輸入的幼稚T細胞快速、活躍地分裂增生，提示淋巴細胞減少狀態(tài)下能激發(fā)淋巴細胞自穩(wěn)性增生[5]。而在淋巴細胞自穩(wěn)性增生過程中，因殘存少量的淋巴細胞能擁有足夠的空間及資源進行分裂增殖，有助于增強記憶樣T淋巴細胞對抗原的敏感性，使殺傷功能一定程度上調(diào)[6-7]，提示化療能誘使機體朝正向免疫應(yīng)答發(fā)展。國外已證實，香菇多糖局部給藥亦可促進腫瘤組織內(nèi)免疫細胞功能及腫瘤特異性的殺傷性T淋巴細胞誘導(dǎo)增強，同時兼有促進局部產(chǎn)生化學(xué)性胸膜炎，有使胸膜粘連、胸膜腔閉塞的作用。胸腔內(nèi)局部用藥后，香菇多糖濃度較高，藥物可經(jīng)胸膜吸收進入血液循環(huán)，直接調(diào)節(jié)人體的免疫機制，對腫瘤產(chǎn)生“雙路徑”治療作用。其與化療聯(lián)合應(yīng)用能改變抗癌藥的化學(xué)敏感性，協(xié)同增效控制惡性胸水的滲出，還可增強機體免疫功能，且可防止后者所致骨髓抑制、白細胞減少等不良反應(yīng)的發(fā)生。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞具有無反應(yīng)性和免疫抑制性，對CD4+CD25-T細胞、NK細胞、樹突狀細胞和單核細胞等多種免疫細胞均有抑制作用，可以防止自身免疫現(xiàn)象的發(fā)生；但CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞大量累積致使細胞毒性淋巴細胞（CTL）活性降低和輔助性T細胞產(chǎn)生IL-2能力下降，從而使CTL啟動的機體抗感染能力和免疫耐受作用受到影響[8]。目前，臨床上研究和利用人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的最大障礙是缺乏理想的特異性標記物。近來認為，F(xiàn)oxP3基因是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分化發(fā)育和功能維持的重要調(diào)控基因[9]，因此主要以CD4+CD25high和F0xP3作為人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的特異性標記物。但經(jīng)FoxP3標記后的細胞已被破壞，不能用于進一步的培養(yǎng)和研究；CD127可幫助識別CD4+CD25+T細胞和活化T細胞。因此CD4+CD25+CD127low三標記法是檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞最理想的指標[10]。CD4+CD25+CD127high是指活化的效應(yīng)性T細胞，調(diào)節(jié)性T細胞能阻止效應(yīng)性T細胞的過度增殖和活化，從而發(fā)揮其免疫抑制作用[11]。另有研究表明,隨著 CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性 T細胞的減少，CD4+CD25+CD127highT細胞的增殖指數(shù)逐步增高[12]。本研究結(jié)果亦提示，胸腔內(nèi)注入順鉑聯(lián)合香菇多糖后CD4+CD25+CD127high明顯升高，治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，胸腔內(nèi)注入順鉑聯(lián)合香菇多糖能影響患者胸水中的Treg細胞的水平，可能對胸腔內(nèi)微環(huán)境的免疫功能有一定的優(yōu)化作用，一定程度上能活化抗腫瘤免疫應(yīng)答。

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Changes of regulatory T cells in pleural effusion of lung cancer patients with malignant pleural effusion undergoing cisplatin/lentinan treatment

Objective To investigate the changes of regulatory T cells in pleural effusion in lung cancer patients with malignant pleural effusion undergoing cisplatin/lentinan treatment．MethodsSixty lung cancer patients with malignant pleural were assigned into two groups：patients in control group(n=30)received 40mg or 50mg cisplatin in pleural effusion,patients in study group(n=30)received 40mg or 50mg cisplatin plus 4mg lentinan．The levels of CD4+CD25+CD127lowand CD4+CD25+CD127highin pleural effusion were detected before and d7,d14 after treatment．ResultsThe remission rate(RR)in study group was significantly higher than that in control group(P＜0．05);and there was no significant difference in adverse reactions between two groups (P＞0．05)．There were no differences in levels of CD4+CD25+CD127lowand CD4+CD25+CD127highbefore and d 7 after treatment between two groups(P＞0．05);while the level of CD4+CD25+CD127lowin study group was lower and CD4+CD25+CD127highwas higher than those in control group at d14 after treatment(P＜0．01 or 0．05)．Compared to those before treatment the level of CD4+CD25+CD127lowwas reduced and CD4+CD25+CD127highwas elevated at d7 and d14 after treatment(P＜0．01 or 0．05)．ConclusionThe levels of the regulatory T cells in pleural effusion are changed after cispatin combined with lentinan treatment,which may be associated with the improvement of local immune status of pleura．

Lung cancer Pleural effusion Cispatin Lentinan Regulatory T cells

2013-07-17）

（本文編輯：歐陽卿）

311800 諸暨市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科