西葫蘆細菌性莖基軟腐病病原的分離與鑒定

董海龍，王建明(山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

2012-2016年，作者在山西省晉中市榆次區(qū)、太谷縣、大同市靈丘縣、運城市芮城縣等地調(diào)查發(fā)現(xiàn)溫室蔬菜西葫蘆瓜根莖基部產(chǎn)生一種病害，癥狀與中國胡秀芳等報道的半夏細菌性軟腐病[1]和中國高必達等報道的朝鮮薊細菌性根莖腐爛病[2]、馬來西亞E. Nazerian et al.報道的卷心菜軟腐病[3]、韓國OKHEE CHOI et al.報道的辣椒根莖軟腐病[4]、韓國Jeong Ho Kim et al.報道的仙人掌軟腐病[5]、伊朗ESMAEIL MAHMOUD報道花貝母軟腐病[6]相似。該病害與李林在山東省12個縣區(qū)報道的西葫蘆軟腐病病癥相似[7]，可導(dǎo)致溫室西葫蘆莖基部腐爛，整株枯萎死亡，尤其在重茬3年以上的溫室內(nèi)，發(fā)病率為40%～60%，嚴重影響溫室西葫蘆種植。本研究利用形態(tài)鑒定結(jié)合分子生物學技術(shù)，明確該病病原，以便為生產(chǎn)提供防治依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病情調(diào)察

2012-2013年，溫室蔬菜西葫蘆生長季節(jié)，在山西省晉中市榆次區(qū)、太谷縣等莖基部腐爛的發(fā)生嚴重的地塊進行病情調(diào)查，并定期系統(tǒng)觀察此病害的發(fā)生危害情況，詳細記載每個時期癥狀及發(fā)病率。

1.2 病原的分離及純化

自榆次區(qū)上戈村、太谷縣郝村溫室內(nèi)采集罹病植株，病原菌分離與純化參照方中達植病研究法方法進行[8]。將經(jīng)過表面消毒病組織研碎后移植到滅菌培養(yǎng)皿中，利用NA培養(yǎng)基適溫培養(yǎng)病組織。

1.3 病原菌的致病性測定與重新分離

1.3.1 沾根浸泡法

選取長度為15～20 cm，具有4片針葉的健康無病西葫蘆苗，移栽營養(yǎng)缽之前，在稀釋的106CFU·mL-1的菌液中沾根浸泡1 min，后移栽直徑為10 cm的營養(yǎng)缽中，澆水保濕恒溫培養(yǎng)，對照組分別在無菌液的NA液體培養(yǎng)基中沾根浸泡1 min，恒溫保濕培養(yǎng)[9]。

1.3.2 針刺法

將細菌配置成106CFU·mL-1懸浮液，加入幾滴吐溫20，選取長度為15～20 cm，具有4片針葉的健康西葫蘆苗，用針注入莖基部，保濕培養(yǎng)[9]。

取明顯發(fā)病的植株，按照1.2的方法重新分離病原菌。

1.4 西葫蘆莖基軟腐病的病原形態(tài)鑒定

通過柯赫氏法則確定具有致病性的細菌進行形態(tài)學鑒定。

1.5 生理生化反應(yīng)鑒定

按照伯杰細菌鑒定手冊的方法鑒定[10]。

1.6 病原菌的16srDNA片段的擴增和序列分析

1.6.1 致病菌DNA提取

參考E. Mahmoudi.方法[6]

1.6.2 16S rDNA片段的擴增

參考E. Mahmoudi.方法[6]

1.6.3 PCR產(chǎn)物的克隆測序

PCR擴增產(chǎn)采用雙向測序，拼接序列，與GenBank中對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行相似性比對，將CY39序列與其相似序列用mega4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 危害癥狀

溫室調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病主要開始于西葫蘆莖基部，后期整株開始萎蔫，葉片和果實未有病斑(圖1 A)；莖基部開始出現(xiàn)軟腐癥狀，并伴有惡臭味(圖1B)；后期主側(cè)根軟腐(圖1C)；西葫蘆莖基部主莖部位變褐腐爛，早期軟腐，后期干燥變酥(圖1D)。

圖1 西葫蘆根莖軟腐的田間癥狀Fig.1 The field symptoms of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot

田間發(fā)病情況見表1和表2。從表中可以看出，該病為始于2月，苗期不發(fā)病。造成田間產(chǎn)量損失19.4%～45.6%。

表1 西葫蘆根莖軟腐病的田間發(fā)病率/%Table 1 The field morbidity of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot

2.2 病原菌的分離及致病性測定

從山西省溫室采集到的西葫蘆發(fā)病植株中分離純化一株優(yōu)勢明顯的菌株，分別命名為CY39，分別對西葫蘆采用沾根浸泡法和針刺法回接CY39，同時設(shè)置空白培養(yǎng)液作對照。結(jié)果表明，沾根接種3 d后，接種CY39菌株的西葫蘆出現(xiàn)萎蔫癥狀(圖2B)；對照組未出現(xiàn)此癥狀(圖2A)；莖基部軟腐變褐(圖2C左)；圖C右對照莖基部未見褐變。

表2 山西省西葫蘆根莖軟腐病在6月的發(fā)病情況調(diào)查Table 2 Investigation on the incidence of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot in Shanxi province in June

圖2 接種CY39后西葫蘆表現(xiàn)的癥狀Fig.2 Symptoms produced on Cucurbita pepo L. by inoculation of CY39

按照方法1.2重新分離發(fā)病的西葫蘆上病原菌，結(jié)果西葫蘆上分離到病原菌與CY39培養(yǎng)形態(tài)完全一致?？梢奀Y39是引起西葫蘆莖基軟腐病的致病菌。

2.3 菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征

菌落形態(tài)觀察表明CY39在NA培養(yǎng)基上菌落成灰白色圓形，凸起，半透明狀，有光澤。革蘭氏染色呈陰性。電鏡顯微觀察，菌體短桿狀，兩端鈍圓，具鞭毛(圖3)。

圖3 在掃描電鏡下的形態(tài)和鞭毛特征Fig.3 Bacterial cell shape and flagella of CY39 after flagellum staining(20 000×)

2.4 菌體生理生化特征

與胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovora)生理生化特征比較，CY39與胡蘿卜軟腐果膠桿菌其相似程度最大(表3)。

2.5 CY39的16S rDNA序列測定分析結(jié)果

由于CY39形態(tài)和生理生化特征上表現(xiàn)出與胡蘿卜軟腐果膠桿菌高度相似性，本研究選用CY39進行分子生物學鑒定。

用引物對(27FG09上游引物)5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；(1 540 r下游引物)5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'做雙向PCR擴增其16SrDNA，電泳結(jié)果如圖4所示， DNA片段回收測序后全長1 462 bp。

采用MEGA4軟件以16S rDNA相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。從圖5中可以看出，與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上相似序列經(jīng)BLAST比對的結(jié)果表明，該菌株與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)AB680280報告的序列相似度為100%。

表3 CY39和果膠桿菌屬的形態(tài)和生理生化特征比較Table 3 Comparison of physiological and biochemical characteristics CY39 with Pectobacterium carotovora

注：+：陽性反應(yīng) -：陰性反應(yīng)

Note：+：Positive reaction； -：Negative reaction

圖4 CY39的16SrDNAPCR電泳產(chǎn)物Fig.4 EIectrOohresis of PCR product of 16S rDNA of CY39

3 討論

據(jù)調(diào)查，山西2007年設(shè)施蔬菜種植面積達10 hm2，西葫蘆溫室栽培面積大，重茬現(xiàn)象非常嚴重，導(dǎo)致西葫蘆細菌性莖腐爛病的發(fā)生呈上升局勢，對設(shè)施西葫蘆生產(chǎn)造成嚴重影響。因此，今后對該病害做系統(tǒng)性研究具有重要的理論和實踐意義。

西葫蘆屬葫蘆科植物，其在設(shè)施蔬菜高效栽培中面積逐年擴大，有關(guān)西葫蘆根腐病、莖基腐病的報道主要是鐮孢屬、疫霉屬真菌引起[11]。椐報道胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovarasubsp.carotovora)引起西葫蘆莖基部軟腐[7]，癥狀特點與本文中報道的特點相似，按照最新的植物病原細菌分類，胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種已歸屬胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)[12]。本文報道的莖基部、主根、側(cè)根受害后腐爛，并伴有惡臭味，濕度大時有菌濃產(chǎn)生，莖基部往上逐漸軟腐。

查閱近十年來國內(nèi)外報道，胡蘿卜軟腐果膠桿菌主要引起卷心菜[3]、辣椒[4]、仙人掌[5]、西葫蘆等軟腐病[7]。有關(guān)該病害的地理分布和發(fā)病規(guī)律等是今后研究的一個重點課題。

Indira del C.M. Alvarado et al.通過對伯南布哥州的24個土壤樣本分析發(fā)現(xiàn)，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種數(shù)量與土壤結(jié)構(gòu)、芽孢桿菌數(shù)量有顯著的相關(guān)性[13]。Grace Kwan et al.通過研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌酸化胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種微需氧環(huán)境，抑制細菌的生長，比值是O157：H7[14]?？梢詾榇瞬『Φ姆乐翁峁┬滤悸贰dilce I. H. Benelli et al.分別通過對四個馬鈴薯品種接種胡蘿卜果膠桿菌，結(jié)果表明不同抗病品種對軟腐病菌有不同的表現(xiàn)[15]。Young-Jin Koh et al.通過轉(zhuǎn)入BL1基因進入蕪青中抵抗胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種，顯著提高了蕪青的抗病性[16]。有關(guān)西葫蘆莖基軟腐病的防治和抗病性表現(xiàn)有待做進一步深入的研究。

4 結(jié)論

利用形態(tài)學觀察結(jié)合生理生化特性測定及分子生物學分析方法，鑒定了危害溫室蔬菜西葫蘆根莖部的一種病原細菌，即胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種。它可導(dǎo)致西葫蘆莖基部軟腐。發(fā)病規(guī)律調(diào)查中發(fā)現(xiàn)該菌致病性強，條件適宜時潛育期短，發(fā)病快，且春季危害較重。因此，今后因加強該病害系統(tǒng)性研究。

圖5 基于16SrDNA區(qū)堿基序列構(gòu)建的CY39系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 CY39 phylogenetic tree based on 16SrDNA region sequences

參 考 文 獻

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