一株百合枯萎病菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

翟雅鑫，姚晨陽，薛麗芳，曹揮，李新鳳，杜方，郝曉娟*(.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 03080；.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 03080)

近年來，花卉產(chǎn)業(yè)成為了中國的新興產(chǎn)業(yè)。2013年，國家林業(yè)局發(fā)布了《全國花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃 (2010-2020年)》，明確了花卉產(chǎn)業(yè)對促進(jìn)農(nóng)民增收致富，培育新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)的重要意義[1]。山西省花卉產(chǎn)業(yè)經(jīng)過近年來的發(fā)展，生產(chǎn)基地已遍布全省各地，切花花卉成為了山西花卉五大類產(chǎn)品系列之一，其中百合鮮切花的市場需求量以每年20%以上的速度增長，發(fā)展空間巨大[2]。

百合枯萎病是百合的主要病害之一，防治困難，目前已成為百合花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。該病發(fā)病率一般為5%～30%，個別地區(qū)可達(dá)40%～50%，百合大面積栽培地和連作田塊的發(fā)病率更是高達(dá)70%以上，嚴(yán)重影響百合的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3～8]。

百合枯萎病是由鐮刀菌(Fusarium)侵染引起的一種土傳真菌病害。不同地區(qū)、不同品種百合枯萎病病原菌存在差異。李誠等報(bào)道甘肅地區(qū)百合枯萎病病原菌包括尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和茄腐皮鐮刀菌(F.solani)[9]。Li等從寧夏地區(qū)觀賞百合品種(Sorbonne)枯死植株中分離出了三線鐮孢菌(F．tricinctum)[10]。江西地區(qū)龍牙百合枯萎病由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮鐮刀菌(F.solani)復(fù)合侵染引起[11～13]。在對國外百合品種的枯萎病研究中，福建出入境檢驗(yàn)檢疫局曾截獲帶有枯萎病菌的日本百合種球，分離鑒定證明該菌為層出鐮刀菌(F.proliferatum)[14]。Ana通過進(jìn)行病原菌鑒定發(fā)現(xiàn)西班牙百合枯萎病的致病菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和層出鐮刀菌(F.proliferatum)[15]。L?ffler等提出荷蘭百合枯萎病的主要病原菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)[16]。百合枯萎病病原菌種類繁多，不同種鐮刀菌致病性的差異致使該病害的防治更加困難[5]。

病原菌種類及其生物學(xué)特性的明確是研究病害流行規(guī)律和進(jìn)行病害防治的基礎(chǔ)工作。因此，本文對山西太谷地區(qū)百合枯萎病病原菌及其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 病株采集及病原菌的分離純化

從山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合試驗(yàn)田采集百合枯萎病病株，百合品種為Matrix，屬于亞洲百合雜種系。采用組織分離法分離病原菌[17]，獲得的菌株于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

亞洲百合Matrix種球經(jīng)次氯酸鈉消毒、無菌水沖洗后，在106個· mL-1孢子懸浮液中浸泡10 min，定植，在25 ℃條件下培養(yǎng)。以浸泡無菌水為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。觀察記錄發(fā)病狀況并進(jìn)行病原菌再分離。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)鑒定參照Lesile的方法進(jìn)行[18]，將分離物接種于PDA 培養(yǎng)基，在25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)。觀察其培養(yǎng)性狀，并在光學(xué)顯微鏡下觀察分離物的形態(tài)特征。

1.4 病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析

CTAB法提取病原菌DNA[19]。采用通用引物ITSl (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) 擴(kuò)增病原菌ITS片段。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol·L-1Mg2+1.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、DNA模板1 μL、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL、ITSl /ITS4各1 μL，dd H2O 13.2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸l min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到530 bp左右的擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對和同源性分析。以Colletotrichumgloeosporioides(登錄號DQ084495)為外群，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建序列的近鄰歸群(neighbor-Joining，NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生物學(xué)特性研究

1.5.1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

用直徑5 mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)5 d的百合枯萎病菌菌落邊緣打取菌餅，將其轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，分別放置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。7 d時采用十字交叉法測量菌落直徑，8 d時測定該菌的產(chǎn)孢量。產(chǎn)孢量測定：于平皿中加入10 mL無菌水洗脫菌落表面的孢子，使用血球計(jì)數(shù)板測定孢懸液濃度[20]。新復(fù)極差法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5.2 pH對菌落生長及產(chǎn)孢量的影響

配制pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 的PDA培養(yǎng)基，將百合枯萎病菌菌餅(d=5 mm)分別接至不同pH值的PDA平板中，25 ℃恒溫條件培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)采集及處理方法同1.5.1。

1.5.3 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

參考李敏等[21]的方法，以查彼克(Czapek)固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以含等質(zhì)量碳素的葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、半乳糖作為碳源。以含等質(zhì)量氮素的蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、甘氨酸、硝酸銨作為氮源，配制成含不同碳源、氮源的培養(yǎng)基。將枯萎病菌菌餅(d=5 mm)分別接至含有不同碳源、氮源的平板中，以不添加碳源、氮源作為對照，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采集及處理方法同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

百合枯萎病主要危害百合的肉質(zhì)根和鱗莖盤基部，病原菌侵染后，受害部位變褐腐爛，向上擴(kuò)展導(dǎo)致鱗莖出現(xiàn)不規(guī)則的褐色病斑(圖1 A)，后期鱗片從盤基部散開并易剝落。莖基部同樣出現(xiàn)黃褐色病斑，潮濕環(huán)境下產(chǎn)生白色霉層。地上部癥狀表現(xiàn)為葉片發(fā)黃萎蔫(圖1B)。病害發(fā)生后期，整株枯死。

2.2 分離與純化結(jié)果

從發(fā)病百合鱗莖組織分離純化獲得2種形態(tài)不同的鐮刀菌，分別選擇代表菌株SXLWF11、SXLWF23進(jìn)行致病性測定。

2.3 致病性測定結(jié)果

接種SXLWF23的百合植株，3 d后葉尖開始發(fā)黃，之后葉片逐漸萎蔫。鱗莖出現(xiàn)褐色病斑，鱗片從盤基散開，無菌水對照不發(fā)病(圖1C)。從發(fā)病植株上再次分離獲得菌株與接種菌株一致。接種SXLWF11的百合植株不發(fā)病。試驗(yàn)結(jié)果表明SXLWF23是百合枯萎病的病原菌。

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上SXLWF23菌落圓形，氣生菌絲白色(圖2 A)，背面產(chǎn)生粉紫色色素(圖2B)。瓶梗式產(chǎn)孢，小型分生孢子橢圓形或棍棒形，無分隔，大小4.5～11.0 μm × 2.1～5.8 μm，常聚生于分生孢子梗頂端，呈假頭狀或串珠狀排列(圖2C，2D)。大型分生孢子較少，鐮刀形，3～5個分隔，大小12.4～39.9 μm × 2.5～5.2 μm(圖2D)。

圖1 百合枯萎病癥狀(A. 田間鱗莖發(fā)病癥狀；B. 田間植株發(fā)病癥狀； C. 人工接種病原菌后發(fā)病癥狀，左：無菌水對照，右：接種病原菌.)Fig.1 Symptoms of lily wilt disease( A. Symptom of bulb in the field; B.symptom of plant in the field; C. The symptom of artificial inoculation with pathogen. Left: sterile water CK; Right: pathogen)

圖2 病原菌形態(tài)特征(A-B. PDA上培養(yǎng)5 d后的菌落形態(tài)；C. 產(chǎn)孢梗；D. 分生孢子.)Fig.2 Morphological characteristics of the pathogen( A-B. Colony cultured on PDA in darkness for 5 days；C. Microconidia in situ on PDA；D. Conidia)

2.5 病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析

用引物ITSl和ITS4對菌株SXLWF23進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將序列提交至GenBank，獲得的登錄號為MG461559。同源性序列分析結(jié)果表明，SXLWF23與層出鐮刀菌(F.proliferatum)(登錄號GQ942905)的相似性為98%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，SXLWF23與層出鐮刀菌(F.proliferatum)聚為一個分支，支持率99%(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將SXLWF23鑒定為層出鐮刀菌(F.proliferatum)。

圖3 rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationship tree among SXLWF23 and other Fusarium strains based on the internal transcribed spacer rDNA gene sequences. The tree was generated using MEGA 6.0 software.

2.6 生物學(xué)特性研究

2.6.1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

不同溫度對SXLWF23菌株菌絲生長、和產(chǎn)孢的影響具有一定差異(圖4)。病原菌在10～35 ℃范圍內(nèi)均可生長，25～30 ℃生長最快。溫度低于5 ℃或高于40 ℃時，菌落停止生長。病原菌在10～35 ℃范圍均能產(chǎn)孢，25～30 ℃條件下產(chǎn)孢量最大，顯著高于其它溫度處理(P<0.05)，5 ℃、40 ℃條件下病原菌不產(chǎn)生分生孢子。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對SXLWF23菌株菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

2.6.2 pH對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

SXLWF23菌株菌絲生長對pH值不敏感，在pH 2～11范圍內(nèi)均可生長(圖5)。菌絲生長最適pH為7，7 d時菌落直徑可達(dá)7.63 cm?？傮w來看，中性及偏堿性的環(huán)境條件比酸性條件更有利于菌絲的生長。病原菌在pH值2～11范圍為內(nèi)均能產(chǎn)孢，最適pH值為6～7。

圖5 不同pH對SXLWF23菌株菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of pH value on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

2.6.3 不同碳源、氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

從表1可以看出，SXLWF23菌株在供試的7種碳源上均可生長，但對各碳源利用程度不同。其中乳糖和蔗糖最利于菌絲生長，而麥芽糖抑制菌絲生長。從產(chǎn)孢量來看，以蔗糖為碳源時，病原菌產(chǎn)孢量最大，而麥芽糖和可溶性淀粉會抑制病原菌產(chǎn)孢。

各供試氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響與不加氮源的對照相比均具有顯著促進(jìn)作用(表1)。7 d時添加不同氮源的菌落直徑的大小順序依次為：蛋白胨>甘氨酸>硝酸鈉>尿素>硝酸銨>硫酸銨>氯化銨>無氮源對照。以蛋白胨為氮源時，菌絲生長最快。8 d時添加不同氮源的產(chǎn)孢量的大小順序依次為：甘氨酸>尿素>蛋白胨>硝酸銨>硫酸銨、硝酸鈉>氯化銨>無氮源對照。甘氨酸處理下產(chǎn)孢量最大。在無碳源或者無氮源的條件下，病原菌雖能生長，但菌絲稀疏，需在透光條件下才能看到。

表1 不同碳源、氮源對SXLWF23菌株菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 1 Effects of carbon or nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

注:不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)，小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.01 level and lowercase letters mean significant differences at the 0.05 level in the same column.

3 結(jié)論與討論

層出鐮刀菌(F.proliferatum)可侵染多種植物，造成植物根、莖、葉的腐爛萎蔫，引起苗枯、穗腐、根部腐爛等病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[22]。本試驗(yàn)從百合病株中分離得到層出鐮刀菌(F.proliferatum)并通過致病性測定確定該菌為太谷地區(qū)百合枯萎病病原菌。

生物學(xué)特性研究表明該菌生長和產(chǎn)孢的溫度范圍為10～35 ℃，最適溫度為25～30 ℃。菌絲生長的最適pH為7，產(chǎn)孢最適pH值為6～7。這與王明道、韓冰等報(bào)道的層出鐮刀菌的生物學(xué)特性具有相同的特點(diǎn)[23、24]。本試驗(yàn)中，促進(jìn)菌絲生長的最佳碳源為蔗糖、乳糖，最佳氮源是蛋白胨。與王明道[23]報(bào)道的地黃根腐病病原菌菌株ZJ1生長最適碳源為葡萄糖、蔗糖，最適氮源為硝酸鉀、蛋白胨的結(jié)論相近。韓冰等[24]對茄子層出鐮刀菌花腐病病原菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，菌株Fp01生長最適碳氮源分別為麥芽糖和硫酸銨，這與本試驗(yàn)結(jié)論不同，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是寄主不同導(dǎo)致鐮刀菌對碳源、氮源的利用情況不同。促進(jìn)菌絲生長的最佳氮源是蛋白胨。促進(jìn)產(chǎn)孢的最佳氮源為甘氨酸。說明該菌在菌絲生長和分生孢子產(chǎn)生過程中對氮源具有不同的偏好。以麥芽糖為碳源時，可以顯著抑制菌絲生長和產(chǎn)孢。在實(shí)際生產(chǎn)情況中可以使用對病原菌生長和產(chǎn)孢有抑制作用的碳源和氮源作肥料，減緩病害的發(fā)生。

參 考 文 獻(xiàn)

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