常見蜂蜜和糖漿特征成分及功能性差異研究

吳伋 徐錦忠 陳磊

（1 Saint Louis University High School，St.Louis 63110；2 江蘇中譜檢測有限公司，南京 210061；3 江蘇出入境檢驗檢疫局，南京 210001）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質。作為傳統(tǒng)的天然營養(yǎng)物質，在世界范圍內都具有悠久的食用歷史。傳統(tǒng)中醫(yī)藥中蜂蜜也是重要的原材料，具有多種藥理功能，對其藥用價值的開發(fā)利用研究已經有較長的歷史[1]。

優(yōu)質蜂蜜在室溫下放置數年不會腐敗，表明其防腐作用極強。實驗證實，蜂蜜對鏈球菌、葡萄球菌、白喉桿菌等革蘭陽性菌有較強的抑制作用?！白杂苫睂W說，是英國學者哈曼（Deham Harman）于1954年首先提出的一個重要衰老機制，認為人體衰老是體內過量的自由基引起的。蜂蜜中含有大量的抗氧化劑，它能清除人體內“垃圾”——氧自由基，從而達到延緩衰老的作用，蜂蜜的抗氧化性、抗菌性等已經被廣為研究[3-5]。

近年來對于不同蜜種蜂蜜通過特征性組分進行鑒別研究，但方法比較復雜，很難確定各蜜種中獨特的特征組分[6-13]。在糖漿摻假蜂蜜的檢測研究中，通過液相色譜-質譜方法發(fā)現糖漿和蜂蜜中的差異進行摻假檢測[14,15]，因此研究不同蜜種中的特征性成分和蜂蜜、糖漿之間的差異性意義很大。

本文針對市場上存在的糖漿冒充蜂蜜的情況，通過液相色譜-質譜聯(lián)用的方法研究蜂蜜和糖漿之間的差異，發(fā)現蜂蜜和糖漿的特征峰，為進一步研究蜜種鑒別和摻假檢測奠定基礎。通過實驗驗證了常見蜂蜜和糖漿在抗氧化性、抑菌性方面的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

蜂蜜市場上蜜種繁多，但是很多蜜種由于產量和蜜源植物種植面積的問題，蜂蜜的純度很難保證，為了保證研究結果的可靠性和中國市場的普遍性，經過市場調查后，選擇了市場上最常見的6種蜂蜜，根據蜜種分為喬木類：洋槐，棗花；灌木類：荊條，麥盧卡；草本類：油菜，蕎麥；以及最常見的2種蜂蜜摻雜的糖漿：大米糖漿，甜菜糖漿。

6種蜂蜜中洋槐、荊條、棗花、蕎麥和油菜直接取自盛花期蜂農的蜂箱，保證蜜種的純度。麥盧卡蜂蜜來自新西蘭麥盧卡協(xié)會提供的樣品。大米糖漿和甜菜糖漿來自相關研究機構，保證樣品的可靠性。

1.2 化學試劑

除特殊說明外，所有試劑為分析純試劑，水為符合國標要求的二級水，70%乙醇，碳酸鈉，磷酸，鐵氰化鉀，福林試劑，沒食子酸標準品（≥98%，10 mg）。

1.3 實驗器材

液相色譜-質譜聯(lián)用儀Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra配ESI源；電子天平：0.01 g和0.01 mg；氮吹儀，恒溫水浴鍋，離心機，渦旋加速器，滴定管，移液槍。

1.4 液相色譜-質譜分析測定

1.4.1 實驗材料制備

準確稱取1.0（±0.05）g蜂蜜樣品于50 ml玻璃離心管中，溶解于10.0 ml水中，超聲至溶解，混勻，過水相濾膜后，準備進樣。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Sepax GP-C8柱，2.1 mm（內徑）×150 mm，5 μm；柱溫：室溫；流動相：甲醇（B）-水（A）；梯度洗脫程序：0～0.5 min 5%B，0.5～3.0 min 5%B～20%B，3.0～6.0 min 20%B～90%B，6.0～8.0 min 90%B，8.1～10.0 min 5%B；流速：0.25 ml/min；進樣量：25 μl。

1.4.3 質譜條件

離子源：ESI+。（a）離子噴霧電壓：2500 V；（b）霧化氣壓力：50 arb；（c）輔助氣壓力：8 arb；（d）毛細管溫度：350℃；（e）離子源溫度：300℃；檢測方式：全掃描（100～800 amu）。

1.5 總抗氧化性測定方法

1.5.1 抗氧化性標準曲線繪制（鐵氰化鉀還原法）

以400 μg/ml的沒食子酸標準溶液為標準繪制抗氧化性標準曲線，方法如下：在2.5 ml，pH=6.6，即0.2 mol/l磷酸緩沖溶液中加入沒食子酸標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.9 ml，用雙餾水補齊到1 ml，加入1 ml 1%鐵氰化鉀，混合物在50度恒溫條件下加熱20 min。急速冷卻，加入2.5 ml 10%氯乙酸，3500轉離心分離10 min。取上層清液2.5 ml，加2.5 ml雙餾水，再加0.5 ml 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長700 nm下測量吸光度A值。A越大，則樣品的還原能力越強。

1.5.2 試樣抗氧化性的測定

將提取液離心，取上層清液，按照標準曲線繪制的測定方法，依次加入試劑，以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在700 nm處測定吸光，比較其抗氧化活性。

1.6 多酚含量測定

1.6.1 多酚標準曲線的制作

準確稱取沒食子酸標準品200 mg，加少量70%乙醇樣品溶化，用70%乙醇定容至100 ml，搖勻，靜置，再用移液槍吸取20 ml，用70%乙醇定容至100 ml，搖勻，配成濃度為400 μg/ml的沒食子酸標準溶液，待用。

準確吸取濃度為400 μg/ml的沒食子酸標準溶液0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.35 ml于試管中。分別加入蒸餾水2.0，1.95，1.9，1.85，1.8，1.75，1.65 ml，再各自加入福林試劑1 ml，充分震蕩后靜置3～4 min，分別加入10%碳酸鈉1 ml于25度，搖勻置于溫水浴中反應2 h，同時做試劑空白，于765 nm下測定分光度，以含量對吸光度進行直線回歸，計算回歸方程。

1.6.2 試樣多酚含量的測定

將提取液離心，取上清液，按標準曲線繪制的測定方法，依次加入試劑，以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在765 nm處測定吸光度，計算多酚含量。

1.7 打孔法測定抑菌性

取培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌懸濁液于若干培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基加入20 μl懸濁液，然后靜置直到瓊脂凝固為止。每個培養(yǎng)基均勻等距打上6個圓孔，依次加入蜂蜜樣品20 μl，37℃培養(yǎng)1天。隔日比較抑菌圈的半徑大小，并計算平均值，結果填入表內。

2 結果與討論

2.1 液相色譜-質譜實驗

為了研究蜂蜜和糖漿中差異性的原因，通過液相色譜-質譜聯(lián)用的方法對樣品進行分析。同時分析2種糖漿和6種蜂蜜樣品，通過設定的色譜條件對樣品從100～800（m/z）進行全掃描，全掃描圖譜如圖1所示，可以看出2種糖漿中除了2.1 min的糖峰外，在7.0～12.0 min之間幾乎沒有峰，尤其是甜菜糖漿看不到任何峰，而蜂蜜中在這個區(qū)域能看到很多峰。進一步通過提取離子對所得圖譜對比分析，找出糖漿和各種蜂蜜之間的差異物質，結果如表1所示，選擇離子色譜圖見圖2。

圖1 糖漿和蜂蜜的LC-MS總離子流色譜圖

圖2 糖漿和蜂蜜的LC-MS選擇離子流色譜圖

表1 糖漿和蜂蜜中特征離子和保留時間

從表1可以看出，除了甜菜糖漿外，大米糖漿可以確定其中的特征離子為311，與文獻報道的一致[10,11]，對比圖譜見圖2。如果在蜂蜜中檢測出大米糖漿的特征離子就可以確定蜂蜜中添加了一定量的大米糖漿。甜菜糖漿由于其生產工藝簡單，通過這個方法未能發(fā)現明顯的特征離子，需要進一步研究。

從表1也能看出，每種蜂蜜中都能找到區(qū)別于其他蜜種的特征離子，同樣用這種特征離子也可以確定是不是在價格高的蜂蜜如洋槐蜂蜜中添加了價格低的油菜蜂蜜，還有麥盧卡蜂蜜是不是真的麥盧卡蜂蜜，有沒有添加其他蜂蜜。

2.2 抗氧化性實驗和多酚測定實驗

蜂蜜與糖漿相比具有豐富的黃酮和多酚類物質，而這些物質通常具有較好的抗氧化活性。實驗進一步研究了蜂蜜和糖漿的抗氧化性和多酚含量，測定實驗結果如表2所示。這兩個實驗都是用沒食子酸作為參考標準物質，分光光度法測定不同波長下的吸光度，最后折算成沒食子酸含量來定量比較。從表2可以看出，糖漿也具有一定的抗氧化性，但是比蜂蜜小。蜂蜜的抗氧化性和多酚含量的高低是密切相關的。天然蜂蜜隨著顏色的加深，抗氧化活性和多酚含量增加，抗氧化活性和多酚含量基本呈正相關。洋槐和油菜是蜂蜜中相對最低的，顏色也最淡，說明其中含有的多酚類物質少。而深色的棗花、麥盧卡和蕎麥抗氧化活性高，蕎麥是洋槐和油菜的4倍左右。由此可見，從抗氧化活性考慮，應該買顏色深的蜂蜜。

2.3 抑菌性實驗結果

傳統(tǒng)觀念認為蜂蜜具有一定的抑菌效果，特別是麥盧卡蜂蜜，作為全球唯一具有針對胃炎功能的蜂蜜，具有良好的抑菌性。實驗研究了這幾種蜂蜜和糖漿對金黃色葡萄球菌的抑菌效果（見圖3），結果表明只有蕎麥蜜和麥盧卡蜂蜜有明顯的抑菌圈出現，糖漿和其他幾種蜂蜜看不到抑菌效果。

表2 蜂蜜和糖漿的抗氧化活性和多酚含量測定結果

圖3 抑菌實驗的平板圖

3 結論

上述研究確定了洋槐蜂蜜和大米糖漿中的特征離子，為進一步檢測蜂蜜摻雜和造假奠定了基礎。通過抗氧化活性和多酚含量測定，說明蜂蜜中含有來自于植物的多酚類物質，相比糖漿而言具有一定的抗氧化活性。抑菌實驗確定麥盧卡蜂蜜和蕎麥蜜具有一定的抑菌效果，特別是蕎麥蜜可以進一步開發(fā)成功能性保健食品。實驗通過探究不同蜜種的特征離子為蜜種鑒別和摻假檢測奠定了基礎，并驗證了6種常見天然蜂蜜在抗氧化活性、抑菌性方面優(yōu)于糖漿的潛在藥用價值。

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