將顯微注射的蜜蜂卵培育成蜂王的方法

耿海洋 張猛 聶紅毅 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學 蜂學學院， 福州 350002）

近幾年基因編輯技術發(fā)展迅速，特別是CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)，將基因組編輯技術帶到一個新高度。它具有設計簡單、特異性強、效率高等優(yōu)點，這讓很多普通實驗室都可以運用該技術[1]。目前該技術已經(jīng)成功地運用在很多模式生物中，如果蠅[2]、家蠶[3]及斑馬魚[4]等。蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，其產(chǎn)品及其制品在保健行業(yè)和醫(yī)療領域起著越來越重要的作用。同時蜜蜂又是植物重要的傳粉者，其授粉價值和生態(tài)作用更是不可估量。CRISPR/Cas9基因編輯技術平臺在蜜蜂領域中的建立，有助于揭開蜜蜂復雜社會行為與基因功能的關系，也有助于加快蜜蜂優(yōu)良性狀分子育種的進程，具有十分重要的現(xiàn)實意義。2016年，日本學者Hiroki Kohno等[5]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在意大利蜜蜂G0代中敲除了王漿組蛋白mrjp1，但是該研究并沒有在G1代中成功篩選出純合突變體，也沒有真正在蜜蜂領域中建立起CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。因此，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在蜜蜂領域中的建立顯得極為迫切。

蜂卵的顯微注射技術是蜜蜂基因組編輯中最重要的技術之一，而將顯微注射后的蜂卵培育成蜂王是基因編輯技術在蜜蜂領域中應用的不可缺少的重要環(huán)節(jié)，但是截至目前還沒有用顯微注射后的蜂卵培育蜂王的方法的相關報道。由于注射后的蜂卵體表還留有傷口，蜂群中的蜜蜂會將其當作異物直接清理掉，所以它不能像先前報道的移卵育王[6]直接將蜂卵轉(zhuǎn)移到育王杯中。將注射后的蜂卵培育成蜂王的難點主要有4個：其一是顯微注射對蜂卵的安放位置以及傾斜角度要求很高，當完成注射后，很難對蜂卵進行第二次轉(zhuǎn)移，也就不能像Jakob Wegener等[7]用改造的牙鉤將蜂卵轉(zhuǎn)移到涂有蜂蠟的尼龍繩上進行培養(yǎng)；其二是剛孵化的小幼蟲體色接近透明，體表有粘性很難用移蟲針進行轉(zhuǎn)移；其三是室內(nèi)培養(yǎng)至孵化的小幼蟲不像蜂群中孵化的小幼蟲能夠立刻得到內(nèi)勤蜂的照顧并有新鮮的蜂王漿可供享用；其四是在給實驗室內(nèi)的小幼蟲飼喂蜂王漿時也很容易將其淹死。因此如何將顯微注射后的蜂卵培育成蜂王是困擾很多研究者的難題。

目前蜂卵的顯微注射技術日漸成熟，早在1988年，Milne等人就已經(jīng)摸索出一套蜂卵注射方法，每小時可以注射蜂卵100粒，同時可以達到21%的蜂卵孵化率[8]。1998年，邵瑞宜在此基礎上將蜂卵的孵化率提高到35.13%[9]。2017年，本實驗室已經(jīng)能夠?qū)⒆⑸浜蠓渎训姆趸侍岣叩?0%（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。在蜂卵注射的基礎上，本試驗初步提供了幾種用顯微注射后的蜂卵培育蜂王的方法，并通過王臺接受率對這3種方法進行比較，期望能為CRISPR/Cas9基因編輯技術在蜜蜂領域中的建立提供將注射后的蜂卵培育成蜂王的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（STIK, CTHI-150B），育王框，育王杯，移蟲針，蜂王漿，注射器，培養(yǎng)皿，封口膜，針式囚王籠。意大利蜜蜂飼養(yǎng)在福建農(nóng)林大學蜂學學院。

1.2 方法

1.2.1 方法A：在蜂卵孵化前（約68 h）將其轉(zhuǎn)移到蜂群中的育王杯進行育王培養(yǎng)

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿均勻涂在育王框上的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。② 移蟲育王。將在實驗室培養(yǎng)箱中即將孵化的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。③ 割取王漿杯蜂蠟。移蟲的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。④加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

1.2.2 方法B：蜂卵孵化后在實驗室內(nèi)培養(yǎng)12 h再轉(zhuǎn)移到蜂群中的育王杯進行育王

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿涂在育王框的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。②收集蜂王漿。另組織蜂群收集移蟲后48 h生產(chǎn)的蜂王漿[10]，-20℃保存。③ 飼喂蜂王漿。由于注射后的蜂卵在發(fā)育過程中會出現(xiàn)蜂卵孵化時間延長的現(xiàn)象，所以不能提前飼喂食物。在蜂卵的發(fā)育時間達到68 h左右時，用注射器將預熱到34.5℃的蜂王漿食物小心地鋪在正在孵化的小幼蟲下方。④ 移蟲育王。將在實驗室培養(yǎng)箱中已經(jīng)孵化的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。⑤ 割取王漿杯蜂蠟。移蟲的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。⑥ 加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

1.2.3 方法C：蜂卵孵化后在實驗室內(nèi)培養(yǎng)12 h再通過復移方式轉(zhuǎn)移到育王杯育王

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿涂在育王框的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。② 收集蜂王漿。另組織蜂群收集移蟲后48 h生產(chǎn)的蜂王漿[10]，-20℃保存。③ 飼喂蜂王漿。由于注射后的蜂卵在發(fā)育過程中會出現(xiàn)蜂卵孵化時間延長的現(xiàn)象，所以不能提前飼喂食物。在蜂卵的發(fā)育時間達到68 h左右時，用注射器將預熱到34.5℃的蜂王漿食物小心地鋪在正在孵化的小幼蟲下方。④ 移蟲。選取1～2日齡左右自然狀態(tài)下蜂群中的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。⑤ 復移育王。第2天除去未被接收的育王杯，同時移出已被接收的小幼蟲。將培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的小幼蟲用移蟲針轉(zhuǎn)移到已被移除幼蟲的育王杯中，在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后放入蜂群。⑥ 割取王漿杯蜂蠟。復移的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。⑦ 加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

2 結(jié)果與分析

由表1可以看出，方法C的育王效果最好，接受率達到38%；方法B次之，接受率為9.1%；方法A最低，接受率僅為1.1%。方法A直接將即將孵化的蜂卵轉(zhuǎn)移到育王杯中，第2天檢查發(fā)現(xiàn)只有1個小幼蟲被接收，其余全被蜜蜂清理。原因一方面可能在于蜂卵長時間在培養(yǎng)箱中發(fā)育，沒有蜂群的氣味，所以被蜜蜂當作異物清理掉了；另一方面可能是因為轉(zhuǎn)移蜂卵會造成物理上的損傷。方法B先將剛孵化的小幼蟲在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后再轉(zhuǎn)移到蜂群中育王。與方法A中轉(zhuǎn)移粘立在巢礎條上的蜂卵相比，方法B中的轉(zhuǎn)移漂浮在蜂王漿上的小幼蟲會減小對幼蟲的物理傷害，而且操作起來也很便捷。方法C比方法B多了1步復移，這樣做的目的是利用蜂群本身生產(chǎn)的蜂王漿去飼喂小幼蟲，一方面可以讓小幼蟲接觸到蜂群中的氣味有利于工蜂接收，另一方面也有利于小幼蟲發(fā)育成蜂王。

表1 將注射后的蜂卵培育成蜂王的3種方法比較

3 結(jié)論與討論

本試驗是在注射后蜂卵的孵化率達到80%的基礎上進行的，注射后蜂卵的培養(yǎng)條件為溫度34℃，濕度98%[5]。在蜂卵注射的基礎上，我們比較了3種將注射后的蜂卵培育成蜂王的方法。在本實驗中，影響蜂卵或小幼蟲被接收的主要因素有2個：其一是蜂卵或小幼蟲長時間在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，體表上已經(jīng)缺少蜂群的氣味信息，轉(zhuǎn)移到蜂群中很容易被蜂群中的蜜蜂清理掉[11]；其二是若直接轉(zhuǎn)移蜂卵或小幼蟲很容易造成較大的物理傷害，因為蜂卵在孵化前后抵抗力很弱，而小幼蟲的體色接近透明，粘在培養(yǎng)皿上很難轉(zhuǎn)移。鑒于這2個因素，方法C通過先在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h待其體色加深漂浮在食物上，解決了小幼蟲轉(zhuǎn)移的問題，然后通過復移的辦法讓小幼蟲在蜂群自身生產(chǎn)的蜂王漿中培養(yǎng)1 h，解決了小幼蟲體表上缺少蜂群氣味的問題，最后達到38%的王臺接受率。盡管目前蜂王的出房率還比較低，原因可能是由于該試驗是在10月中旬完成的，當時的氣溫條件并不適合蜂王的培育[12]，所以才會有這么低的出房率，但是后期可以通過不斷地優(yōu)化實驗條件來提高出房率。

總之，本實驗給出了具體的操作方法用于指導將注射后的蜂卵培育成蜂王。期望后期將實驗條件進一步優(yōu)化，也期望能為CRISPR/Cas9基因編輯技術在蜜蜂領域中的建立提供技術支持。

參考文獻

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