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    量化MRI活體示蹤新型順磁性鐵納米粒子標(biāo)記SD大鼠脂肪源性干細(xì)胞

    2018-05-21 07:06:40湯間儀馬偉瓊張寶林雷正賢陳惠嫻吳敏儀張鼎旋
    中國介入影像與治療學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:藍(lán)染頂葉小腦

    謝 琦,湯間儀,馬偉瓊,張寶林,雷正賢,陳惠嫻,吳敏儀,張鼎旋

    (1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院 廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科,廣東 廣州 510180;2.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院放射科,廣東 廣州 510800;3.惠州中心人民醫(yī)院放射科,廣東 惠州 516001;4.桂林理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,廣西 桂林 541000)

    干細(xì)胞移植后, 可用MR活體示蹤成像監(jiān)測干細(xì)胞在宿主體內(nèi)的存活、遷移以及與宿主組織的整合情況[1-2]。前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)經(jīng)改良多醇法加入聚乙二醇/聚乙烯亞胺(polyethylene glycol/polyehthyleneimine, PEG/PEI)修飾,合成表面為正電荷的氧化鐵納米粒子(polyehthyleneimine modified superparamagnetic iron oxide, PEG/PEI-SPIO)具有更高的穩(wěn)定性、溶解性和強(qiáng)磁性,且可在細(xì)胞水平不需轉(zhuǎn)染劑而直接高效率標(biāo)記脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)。本研究觀察MRI活體示蹤SD大鼠慢性腦缺血模型顱內(nèi)移植經(jīng)PEG/PEI-SPIO標(biāo)記的ADSCs 的效果。

    1 材料與方法

    1.1 模型制作 30只SPF級(jí)雌性SD大鼠(購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),7~8周齡,體質(zhì)量180~200 g,按文獻(xiàn)[6-7]方法永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈6個(gè)月,制成大鼠慢性腦缺血模型。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,確保適宜的溫度、濕度,飼養(yǎng)6個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)獲廣州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 ADSCs移植

    1.2.1 ADSCs的提取、純化、鑒定與PEG/PEI-SPIO的標(biāo)記 提取4周齡以內(nèi)SD大鼠腹股溝處脂肪組織,經(jīng)消化、離心、純化至P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原鑒定;將P3代ADSCs加入PEG/PEI-SPIO共孵育培養(yǎng)進(jìn)行標(biāo)記,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算并調(diào)整標(biāo)記細(xì)胞密度至105/3 μl懸液,置于無菌EP管,37℃水浴保溫,用于移植實(shí)驗(yàn)[3-4]。

    1.2.2 標(biāo)記后ADSCs的移植 將大鼠模型分為PEG/PEI-SPIO標(biāo)記細(xì)胞移植組和未標(biāo)記細(xì)胞移植組,每組15只。采用10%水合氯醛(350 mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠,將其保定于腦立體定位儀,選取右側(cè)側(cè)腦室為移植區(qū),坐標(biāo)為前囟后0.8 mm,前囟旁1.5 mm,深度5.5 mm[7],注入標(biāo)記或未標(biāo)記ADSCs懸液105/3 μl。術(shù)中大鼠體溫維持在36.5℃。

    1.3 MR成像 于移植術(shù)后第7天、14天、21天,每組各取5只模型鼠行顱腦MR成像。采用Siemens Vrio Tim 3.0T MR掃描儀,7 cm腕關(guān)節(jié)線圈,參照文獻(xiàn)[7]定位、麻醉,行以下序列掃描:T1W,TR 600 ms,TE 12 ms,F(xiàn)OV 70 mm×60 mm,矩陣256×233,層厚3.0 mm;T2W,TR 3 700 ms,TE 109 ms,F(xiàn)OV 70 mm×60 mm,矩陣256×256,層厚3.0 mm;T2*W,TR 520 ms,TE 20 ms,F(xiàn)OV 70 mm×60 mm,矩陣256×206,層厚3 mm;T2-mapping,TR 1 100 ms,TE 16、32、48、64 ms,F(xiàn)OV 70 mm×70 mm,矩陣256×206,層厚3.0 mm;SWI:TR 120 ms,TE 45 ms,F(xiàn)OV 80 mm×40 mm,矩陣256×243,層厚0.7 mm。

    1.4 病理學(xué)檢查 MR掃描結(jié)束后,即對(duì)移植后的模型鼠進(jìn)行心臟灌流固定,取鼠腦,于4%多聚甲醛中固定24 h,參照文獻(xiàn)[7]切片,取材從視交叉紋狀體層面到海馬層面、小腦層面,脫水后經(jīng)石蠟包埋,分兩部分用于常規(guī)HE染色及普魯士藍(lán)染色。

    1.5 數(shù)據(jù)采集

    1.5.1 測量T2值 在T2-mapping圖像上,于顳頂葉皮質(zhì)、海馬、小腦選取大小、位置盡量相近的ROI,測量各ROI的T2值,見圖1、2。

    圖1 參考大鼠腦立體定位圖譜,距離基線(聽耳線)的位置為6 mm,選取ROI 1、2代表顳頂葉皮質(zhì),3、4代表海馬 圖2 參考大鼠腦立體定位圖譜,位于基線(聽耳線)的位置,選取ROI 1、2代表小腦

    1.5.2 普魯士藍(lán)染色 參照T2-mapping圖像測量T2值的ROI相應(yīng)層面,取大鼠相應(yīng)部位切片4張,于高倍鏡下(×400)左、右兩側(cè)顳頂葉皮質(zhì)、海馬、小腦分別隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行測量,使每個(gè)區(qū)域5個(gè)視野應(yīng)盡可能大小、位置相同,觀察藍(lán)染顆粒數(shù)量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。所有計(jì)量資料均以±s表示,符合正態(tài)分布且方差齊;采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組同一腦區(qū)、同一時(shí)間點(diǎn)的T2值、藍(lán)染顆粒數(shù)量;采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較同一時(shí)間點(diǎn)左右兩側(cè)腦區(qū)的T2值、藍(lán)染顆粒數(shù)量;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MR表現(xiàn) 于T2WI、T2*WI、SWI可見2組顳頂葉皮質(zhì)、海馬散在類圓形低信號(hào)區(qū),以T2*WI顯示最佳;SWI對(duì)比度雖好,但難以排除血管影響(圖3、4)。小腦均未發(fā)現(xiàn)明顯異常低信號(hào)區(qū)。

    2.2 T2值 移植后第7天,2組各腦區(qū)T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);第14天,標(biāo)記細(xì)胞移植組右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)、右側(cè)海馬T2值較未標(biāo)記細(xì)胞移植組縮短(t=4.795、2.998,P=0.013、0.045),其余各腦區(qū)2組間T2值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);第21天,標(biāo)記細(xì)胞移植組右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)T2值較未標(biāo)記細(xì)胞移植組縮短(t=3.958,P=0.007),其余各腦區(qū)2組間T2值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);見表1。

    2.3 普魯士藍(lán)染色 2組大腦顳頂葉皮質(zhì)、海馬均可見散在藍(lán)染顆粒,小腦組織內(nèi)未見明確藍(lán)色顆粒。標(biāo)記細(xì)胞移植組和未標(biāo)記細(xì)胞移植組移植后各時(shí)間點(diǎn)各腦區(qū)藍(lán)染顆粒數(shù)量見表2,標(biāo)記細(xì)胞移植組移植后各時(shí)間點(diǎn)各腦區(qū)藍(lán)染顆粒數(shù)量均較未標(biāo)記細(xì)胞移植組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腦區(qū)數(shù)量多;2組移植后第14天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)、右側(cè)海馬及第21天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)藍(lán)染顆粒數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.283、1.841、2.062,P=0.029、0.043、0.032)。

    圖3 未標(biāo)記細(xì)胞移植組MRI T1WI(A)、T2WI(B)、T2*WI(C)、SWI(D)于顳頂葉皮質(zhì)及海馬區(qū)可見散在類圓形低信號(hào)區(qū)(箭) 圖4 標(biāo)記細(xì)胞移植組MRI T1WI(A)、T2WI(B)、T2*WI(C)、SWI(D)于顳頂葉皮質(zhì)、海馬區(qū)均見散在類圓形低信號(hào)區(qū)(箭)

    組別移植后第7天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬右側(cè)小腦左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)海馬左側(cè)小腦標(biāo)記細(xì)胞移植組64.25±1.0866.90±1.5470.52±5.5165.08±2.0967.95±0.7772.73±8.76未標(biāo)記細(xì)胞移植組64.28±2.2365.10±2.3070.80±1.4262.73±2.6164.70±2.6768.70±0.24t值0.0100.6500.0480.7031.1700.459P值0.9920.5400.9630.5080.2860.677組別移植后第14天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬右側(cè)小腦左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)海馬左側(cè)小腦標(biāo)記細(xì)胞移植組49.83±0.5055.60±0.3370.83±5.6959.05±1.5364.20±3.2872.53±4.94未標(biāo)記細(xì)胞移植組59.73±2.0162.68±2.3462.78±3.2657.40±1.3364.90±0.4968.83±4.25t值4.7952.9981.2270.8150.2111.730P值0.0130.0450.2770.4470.8400.134組別移植后第21天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬右側(cè)小腦左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)海馬左側(cè)小腦標(biāo)記細(xì)胞移植組55.58±1.6264.20±2.3670.88±3.1459.05±1.9265.68±2.2269.05±3.54未標(biāo)記細(xì)胞移植組62.55±0.7065.48±6.0968.60±4.5760.65±0.8369.00±2.8756.50±3.53t值3.9581.7262.2140.7640.9162.109P值0.0070.1350.0690.4740.3950.056

    表2 2組干細(xì)胞移植后不同時(shí)間不同腦區(qū)藍(lán)染顆粒數(shù)量比較(個(gè)/mm2,±s,n=5)

    表2 2組干細(xì)胞移植后不同時(shí)間不同腦區(qū)藍(lán)染顆粒數(shù)量比較(個(gè)/mm2,±s,n=5)

    組別移植后第7天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬左側(cè)海馬標(biāo)記細(xì)胞移植組6.40±1.705.80±1.165.20±1.045.60±0.88未標(biāo)記細(xì)胞移植組6.40±0.885.20±1.204.00±0.844.80±1.31t值0.0000.7930.8960.561P值1.0000.3610.3820.618組別移植后第14天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬左側(cè)海馬標(biāo)記細(xì)胞組16.40±6.5813.00±5.0016.60±4.8313.0±4.99未標(biāo)記細(xì)胞組6.70±1.348.40±1.246.20±1.106.00±1.21t值2.2831.1331.8411.460P值0.0290.1550.0430.059組別移植后第21天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)左側(cè)顳頂葉皮質(zhì)右側(cè)海馬左側(cè)海馬標(biāo)記細(xì)胞組18.00±8.3410.10±3.517.60±1.267.10±1.27未標(biāo)記細(xì)胞組8.20±2.157.50±0.975.80±1.416.00±1.92t值2.0620.4670.0980.026P值0.0320.6750.9430.989

    3 討論

    既往研究[8-11]表明,腦缺血第1周時(shí)常規(guī)HE染色組織切片未見大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受損,第2周時(shí)6%~29%大鼠海馬CA1區(qū)可見有神經(jīng)元損傷,第4周時(shí)增加至55%,到第8~13周時(shí)可增加至67%,提示腦缺血具有選擇性易損腦區(qū),大腦皮層、丘腦、海馬、紋狀體均為缺血損傷的敏感腦區(qū),其中以海馬最為敏感。本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠海馬、顳頂葉皮質(zhì)和小腦放置ROI,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后顳頂葉皮質(zhì)、海馬出現(xiàn)低信號(hào),與既往研究[6-7]結(jié)果相符;小腦區(qū)未出現(xiàn)異常信號(hào),考慮雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)致大鼠慢性腦缺血時(shí),雖然大鼠顱內(nèi)血流量顯著下降,但由于小腦由椎基底動(dòng)脈供血,小腦血流量下降不明顯,不易受損。

    研究[12-13]表明,移植入腦內(nèi)SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞可定向遷移至腦損傷部位,推測注射入腦室的干細(xì)胞多分布于腦脊液,損傷區(qū)域血腦屏障和腦脊液屏障受到破壞,腦脊液流速和循環(huán)較正常區(qū)域明顯增加,故移植入腦室的干細(xì)胞可向損傷部位遷徙[14]。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記細(xì)胞移植組在移植后第14天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)和海馬及第21天右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)的T2值較未標(biāo)記細(xì)胞移植組縮短,相應(yīng)大鼠腦標(biāo)本普魯士藍(lán)染色顯示藍(lán)染顆粒計(jì)數(shù)亦增多,提示慢性腦缺血可致受損部位鐵含量增加,T2WI、T2*WI表現(xiàn)為低信號(hào),推測PEG/PEI-SPIO標(biāo)記的ADSCs可向因慢性腦缺血致受損的顳頂葉皮質(zhì)、海馬遷移,表明對(duì)于慢性腦缺血大鼠模型,采用臨床型3.0T MR T2值活體示蹤移植PEG/PEI-SPIO標(biāo)記ADSCs腦內(nèi)遷移和分布是可行的。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植后第21天時(shí),2組右側(cè)海馬區(qū)T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,普魯士染色藍(lán)染顆粒計(jì)數(shù)亦呈相同變化??紤]原因,可能在于隨細(xì)胞增殖分裂,細(xì)胞內(nèi)SPIO濃度逐漸稀釋到低于MRI可探測的數(shù)值;而從右側(cè)腦室注射入的移植干細(xì)胞多隨腦脊液循環(huán)進(jìn)入顳頂葉皮質(zhì)區(qū),海馬區(qū)細(xì)胞則通過白質(zhì)神經(jīng)束循環(huán)進(jìn)入,相對(duì)較少。此外,移植細(xì)胞還可穿透胼胝體進(jìn)入對(duì)側(cè)大腦半球,但數(shù)量更少,也難以進(jìn)行MR示蹤[12]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,帶正電荷的PEG/PEI-SPIO標(biāo)記ADSCs移植入慢性腦缺血大鼠模型后,采用臨床型3.0T MR T2值可活體示蹤移植細(xì)胞在大鼠腦內(nèi)的遷移和分布,以同側(cè)顳頂葉皮質(zhì)區(qū)明顯,可持續(xù)到移植后第21天,而海馬區(qū)及對(duì)側(cè)大腦半球難以示蹤。本實(shí)驗(yàn)的主要不足:動(dòng)物模型數(shù)量少,觀察時(shí)長有限。活體情況下,PEG/PEI-SPIO顆粒在ADSCs內(nèi)能持續(xù)標(biāo)記的最長時(shí)間,以及ADSCs分化或凋亡后PEG/PEI-SPIO顆粒的代謝情況等有待進(jìn)一步觀察。

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