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    柚皮苷調(diào)控心肌核因子 NF-κB炎癥信號(hào)通路對(duì)糖尿病心肌病大鼠防治作用①

    2013-09-12 10:55:00涂焰明莫海亮葉少強(qiáng)黃瑞娜梁建光
    中國免疫學(xué)雜志 2013年2期
    關(guān)鍵詞:柚皮苷糖脂心肌病

    游 瓊 吳 鏗 涂焰明 李 騰 莫海亮 葉少強(qiáng) 黃瑞娜 梁建光

    (廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,湛江524001)

    近年來大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病及糖尿病心肌病心肌組織中伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤,炎癥因子的異常表達(dá),提示炎癥反應(yīng)參與了糖尿病心肌病的發(fā)病[1-5]。NF-кB的激活與糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),其作為糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)許多相關(guān)途徑中的中心因子,對(duì)高血糖狀態(tài)下的心肌結(jié)構(gòu)、功能的改變起重要作用,NF-κB激活后可調(diào)控多種炎性因子、細(xì)胞因子(如 TNF-α、IL-6、IL-1β)的表達(dá),從而參與心肌的炎性損傷[1]。柚皮苷,草藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)和橘紅的主要有效成分,其糖苷配體是 4',5,7-羥基黃酮,糖基為鼠李糖基 β-1,2-葡萄糖。已作為抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、減少血栓廣泛應(yīng)用于臨床,另外還有報(bào)道其具有降血糖、降血脂、降血壓等藥理活性[6]。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究表明柚皮苷對(duì)糖尿病大鼠的心肌損傷具有明顯的改善作用,其機(jī)制與柚皮苷改善胰島素抵抗、阻斷FFA活化等作用有關(guān)[7]。鑒于NF-кB通路激活誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)在糖尿病心肌病發(fā)病中的重要作用,柚皮苷在調(diào)節(jié)心肌糖脂代謝基礎(chǔ)上是否進(jìn)一步抑制了NF-кB的激活以減輕心肌炎性反應(yīng)、阻抑糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展呢?值得進(jìn)一步探討研究。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠,雄性,體重(160±20)克,SPF級(jí),合格評(píng)號(hào)SCXK粵2006-0015,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)條件為恒溫(24±2)℃,相對(duì)濕度50% ~70%,飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求。

    1.1.2 藥物 Naringin粉沫(廣東省梅雁藍(lán)藻公司,純度98%);鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司);血糖、胰島素試紙(強(qiáng)生‘中國'醫(yī)療器材有限公司);糖化血清蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所);低密度、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯(北京北化康東臨床試劑有限公司);游離脂肪酸測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);NF-κB多克隆抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 建模 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型對(duì)照組(MC組)。NC組一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);MC組采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周誘導(dǎo)大鼠IR狀態(tài),然后一次性給予腹腔注射1%鏈脲佐菌素30 mg/kg(pH=4.5,4℃配制,隨配隨用)部分破壞胰島β細(xì)胞功能,72小時(shí)后連續(xù)2次空腹血糖 ≥11.1 mmol/L,胰島素敏感指數(shù)降低,且有多飲、多尿、多食現(xiàn)象確定為糖尿病模型,持續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12小時(shí),麻醉,腹主動(dòng)脈采血后迅速取出心臟,用生理鹽水制成10%的組織勻漿,檢測相關(guān)指標(biāo),糖尿病模型組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常改變可認(rèn)為DC建模成功[8]。共46只大鼠完成實(shí)驗(yàn),NC組10只,MC組36只(建模成功率100%,無死亡)。

    1.2.2 分組給藥 MC大鼠分為4組:Naringin高、中、低劑量組(NH、NM、NL組)和模型對(duì)照組(MC組),每組9只。在確定2型糖尿病模型成功后開始給藥,參考 Naringin對(duì) Wistar大鼠系列實(shí)驗(yàn)研究[9-11],將 NH、NM、NL 組分別設(shè)置為 10、20、40 mg/kg;正常組(NC組)和MC組則予以等體積的蒸餾水。

    1.2.3 放射免疫分析外周血炎癥因子 斷尾取血,將3 ml血以3 500 r/min離心10分鐘,取上清-70℃保存,按試劑盒說明書操作分別進(jìn)行放射免疫分析法檢測 TNF-α、IL-6、IL-1β。

    1.2.4 免疫組織化學(xué)法測定 取心肌組織切片,常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫(H2O2)處理清楚內(nèi)源性過氧化物酶。將切片浸入0.01 mol/L,pH=6.0的枸櫞酸緩沖液中,高壓加熱修復(fù)3分鐘后。按試劑盒說明書操作進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測心肌NF-κB表達(dá)。采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定灰度值及陽性光密度。

    1.2.5 心肌組織的形態(tài)學(xué)觀察 動(dòng)物處死后,進(jìn)行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài),透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),每張切片觀察10個(gè)視野。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用兩組間的比較采用t檢驗(yàn),多組間的比較采用One-Way ANOVA分析法,其中兩兩比較用SNK法,并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠脂糖代謝指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹胰島素(FINS)、胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IR)以及游離脂肪酸(FFA)、膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)均顯著升高(P<0.05);而在NH、NM組的糖脂代謝指標(biāo)不同程度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示,Naringin呈劑量依賴性改善DC糖脂代謝的作用。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5,見表1。

    2.2 各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變 糖尿病心肌病(DC組)大鼠心肌細(xì)胞和線粒體排列紊亂,肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞肥大、線粒體腫脹明顯,嵴變寬,細(xì)胞核固縮、裂解;高劑量柚皮苷治療組(HN組)大鼠心肌纖維呈短柱狀,心肌細(xì)胞排列整齊,致密,細(xì)胞核呈橢圓形,線粒體腫脹不明顯,嵴間隙無增寬,排列有序,接近正常,中劑量柚皮苷組(MN組)次之,低劑量柚皮苷干預(yù)組(LN組)無明顯差異,且呈顯著濃度依賴性,見圖1、2。

    2.3 各組大鼠NF-κB及其下游炎癥因子改變 糖尿病心肌病(DC組)大鼠心肌NF-κB蛋白及外周血

    TNF-α、IL-6、IL-1β分泌增加,不同劑量柚皮苷治療后使其表達(dá)不同程度下降,僅高劑量柚皮苷組(HN組)降低水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖3、表2。

    表1 各組大鼠脂糖代謝指標(biāo)(x±s)Tab.1 The comparison of lipid sugar metabolism index in six groups(x±s)

    表2 各組大鼠心肌NF-κB的陽性平均光密度以及外周血炎癥因子(x±s)Tab.2 The comparison of myocardium NF-κB positive vascular density and peripheral inflammation factors in six groups(x±s)

    圖1 各組大鼠心肌HE染色比較(×400)Fig.1 The comparison of HE staining of myocardiumin different groups(×400)

    圖2 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較(×8 900)Fig.2 The comparison of myocardial cell perspective electron microscope in different groups(×8 900)

    圖3 各組大鼠心肌NF-κB蛋白免疫組化比較(×400)Fig.3 The comparison of NF-κB expression of myocardium in different group(×400)

    3 討論

    基于糖尿病心肌病的“消渴、胸痹”癥狀歸屬于“消渴病心積”范疇。在臨床辯證中,消渴病長期陰虛燥熱、脾虛失運(yùn)、痰濕內(nèi)生、氣陰兩虛、陰損及陽、陰陽兩虛等累及心臟,提示糖尿病心肌病中醫(yī)病機(jī)多屬“氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)、心脈痹阻”。根據(jù)中醫(yī)“消補(bǔ)兼施、同治心絡(luò)中痰瘀”的理論,國醫(yī)大師鄧鐵濤方劑中擅用理氣健脾中藥化橘紅治本?。?2]。經(jīng)化橘紅提取分離測定及體外篩選等實(shí)驗(yàn)摸索,我們擬定以其有效成分柚皮苷治療本病。本實(shí)驗(yàn)高糖高脂喂養(yǎng)和一次性腹腔注射低劑量STZ建立的糖尿病心肌病大鼠模型糖脂代謝障礙和心肌形態(tài)學(xué)損傷明顯,而高、中劑量柚皮苷治療6周后明顯改善。該結(jié)果與以往的報(bào)道類似[7,13]。

    NF-κB是對(duì)炎癥、免疫調(diào)節(jié)較為敏感的轉(zhuǎn)錄因子,在氧化還原反應(yīng)過程中起著重要作用。高血糖誘導(dǎo)NF-κB通路激活對(duì)心血管的作用機(jī)制具有特異性:如對(duì)微血管,高血糖可引起AGE的形成及蛋白激酶C(PKC)的激活,從而激活NF-κB導(dǎo)致微循環(huán)病變[14],而在心肌細(xì)胞器,2型糖尿病 NF-κB 的激活,而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加,并引起心肌線粒體功能障礙及心功能不全[15]。糖尿病狀態(tài)時(shí),NF-κB活化可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)(如 TNF-α、IL-6、IL-1β等),引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時(shí)激活NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而擴(kuò)大心肌局部炎癥損傷。而我們前期研究提示糖尿病心肌病心肌損傷與糖尿病機(jī)體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān),而不是單純血糖、血脂升高及心功能不全的直接后果,其作用機(jī)制可能是多方面的因素共同啟動(dòng)宿主劇烈的免疫炎癥應(yīng)答,通過TLR4激動(dòng)后介導(dǎo)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞功能紊亂[3]。因此,柚皮苷單一改善糖脂代謝障礙并不能完全解析其對(duì)糖尿病心肌病心肌損傷的防治作用,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)步研究提示心肌組織NF-κB蛋白的表達(dá)和外周血TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加,觀察到了心肌組織NF-κB途徑的轉(zhuǎn)錄激活,而高、中劑量柚皮苷治療6周明顯抑制了糖尿病心肌病的NF-κB以及其下游細(xì)胞因子的上調(diào),說明柚皮苷可能呈劑量依賴性阻斷糖尿病心肌病的NF-κB途徑的激活,最終防治心肌形態(tài)學(xué)損傷。

    綜上所述,高糖誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程,柚皮苷呈劑量依賴性對(duì)糖尿病心肌病具有明顯的防治作用,其可能機(jī)制是有效地改善心肌糖脂代謝,下調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá),繼而抑制了NF-κB通路的激活。

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