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    肺癌細(xì)胞株表面PD-L1分子表達(dá)對Treg細(xì)胞分化增殖的影響

    2018-05-18 08:33:07李秋澤趙成光
    實(shí)用醫(yī)藥雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株免疫治療分化

    李秋澤,趙成光

    肺癌在所有惡性腫瘤發(fā)病率中占20%[1],由于其能通過種種原因逃逸免疫機(jī)制監(jiān)視[2],所以也是歷年來難以緩解、復(fù)發(fā)率最高的癌癥。常規(guī)治療肺癌的方法如化療、手術(shù)雖有一定成效[3,4],但是多發(fā)患者隨治療時間增長的獲得耐藥性與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移病灶無法根除等情況,總有效果并不如人意,肺癌患者三年以內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)80%[5],五年以內(nèi)復(fù)發(fā)率為10%。調(diào)查患者生存曲線發(fā)現(xiàn),肺癌患者三年生存率為 36%,五年生存率低至15%[6],中位生存期穩(wěn)定在30個月[7]。為了解決這一狀況,免疫治療方法[8]逐漸進(jìn)入肺癌治療領(lǐng)域。T細(xì)胞為殺滅腫瘤細(xì)胞[9]主要參與者,腫瘤細(xì)胞表面 PD-L 分子[10]表達(dá)程度會影響T細(xì)胞的分化生成。所以筆者觀察PD-L1在肺癌細(xì)胞株表面表達(dá)情況,以及其對T細(xì)胞的影響程度,從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與材料流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN COULTER公司),用于流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行自動分選;T細(xì)胞分選試劑盒(美國BECKMAN COULTER公司)用于分選人體外周靜脈血T淋巴細(xì)胞;24孔與96孔培養(yǎng)板(美國COSTAR公司)依次用于PHA與肺癌細(xì)胞株與Treg細(xì)胞共同培養(yǎng);倒置顯微鏡(中國OLYMPUS公司)觀測活化細(xì)胞、拍照,用于檢測最適PHA濃度;健康人的外周靜脈血SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細(xì)胞株 (美國 ATCC公司),熒光染色法檢測細(xì)胞無污染后,用于肺癌細(xì)胞株與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗。

    1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-L1在肺癌細(xì)胞上的表達(dá)

    選取三種肺癌細(xì)胞株生長速率最高的時期,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集外壁生長的細(xì)胞株,用PBS(磷酸鹽緩沖液)離心洗滌2次后再用緩沖液將細(xì)胞重懸,通過流式細(xì)胞儀檢測PD-L1的表達(dá)水平。

    1.3 實(shí)驗方法

    1.3.1 活化因子PHA最適濃度 通過常規(guī)分離Ficooll法[11]分離人體外周靜脈血單核細(xì)胞后再通過免疫磁珠法[12]分選出來的 T 淋巴細(xì)胞與 0、5、10、15、20(μg/ml)共 5個濃度梯度的 PHA 置于 24孔培養(yǎng)板共同培養(yǎng),72 h后倒置顯微鏡觀察,通過細(xì)胞生長狀態(tài)與細(xì)胞團(tuán)數(shù)量進(jìn)行評定,得出最適濃度。

    1.3.2 肺癌細(xì)胞株與外周血Treg細(xì)胞的共同培養(yǎng)

    以TGF-β (轉(zhuǎn)化生長因子-β)與PD-L1抑制素、TGF-β抑制素的存在與否設(shè)置實(shí)驗,實(shí)驗組別設(shè)置為 1、2、3。實(shí)驗 1 組:肺癌細(xì)胞株 X、Treg細(xì)胞、活化因子PHA;實(shí)驗2組:肺癌細(xì)胞株X、Treg細(xì)胞、活化因子PHA、TGF-β;實(shí)驗3組:肺癌細(xì)胞株X、活化因子PHA、PD-L1抑制素與TGF-β抑制素。最后通過流式細(xì)胞法檢測各實(shí)驗組分化的Treg細(xì)胞所占的總體比例。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法確定最終統(tǒng)計的數(shù)據(jù)后,運(yùn)用Graph Prism 5.0統(tǒng)計專用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料采用x±s表示,比較運(yùn)用t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肺癌細(xì)胞株表面PD-L1分子表達(dá)水平運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對對SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細(xì)胞株表面的PD-L1分子表達(dá)水平進(jìn)行檢測并繪制圖像,詳見圖1。

    觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),各肺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1分子表達(dá)程度有所差異。SPCA-1表達(dá)率最高為 (98.5±1.1)%;H1299 次之為 (91.0±3.2)%;A549 最低,為(20.1±6.4)%,三組分別相比都具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。由于SPCA-1肺癌細(xì)胞株中PD-L1分子表達(dá)水平最高,將此細(xì)胞株與Treg細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。

    2.2 肺癌細(xì)胞株表面PD-L1分子表達(dá)水平對誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的影響

    圖1 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖示(三種細(xì)胞株)

    2.2.1 不同濃度活化因子PHA對外周血Treg細(xì)胞的活化程度 通過倒置顯微鏡觀察得知,活化因子濃度為0 μg/ml時Treg細(xì)胞生長狀態(tài)為單個離散型;隨著濃度的升高,Treg細(xì)胞逐漸出現(xiàn)明顯增值,細(xì)胞團(tuán)數(shù)量增加等情況?;罨蜃覲HA濃超過10 μg/ml時,細(xì)胞大量增殖同時出現(xiàn)大面積覆蓋的細(xì)胞凋零聚集而成的黑色細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)實(shí)驗可知,活化因子PHA的最適濃度為10 g/ml。

    2.2.2 共同培養(yǎng)Treg細(xì)胞活化實(shí)驗結(jié)果 1、2組對比發(fā)現(xiàn):Treg細(xì)胞分化2組 (19.70%)多于1組(12.50%),證明TGP-β能夠提高Treg細(xì)胞分化生成比例,且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2、3組對比發(fā)現(xiàn):2組 (19.70%)Treg細(xì)胞分化生成比例多于3組(6.20%),即PD-L1蛋白分子具有誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的能力,與TGF-β同時存在發(fā)揮作用時表現(xiàn)為協(xié)同作用,應(yīng)用抑制劑能夠顯著影響Treg細(xì)胞分化,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 詳見圖 2。

    圖2 實(shí)驗1、2、3的Treg細(xì)胞活化實(shí)驗結(jié)果

    3 討論

    近年來,肺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中占有比重越來越大,而且常發(fā)生在40歲以上有常年吸煙史的人群中。臨床表現(xiàn)為咯血、胸悶脹痛等癥狀,患者常常因此疲于運(yùn)動、難以休息,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量,危及生命健康?;煛⒎暖?、手術(shù)為常用的肺癌治療方法,但由于治療緩解效率低、復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大等情況,治療需要其他的可行治療方案配合或代替常規(guī)肺癌治療手段。腫瘤難以根除一大部分由于其能夠進(jìn)行免疫逃逸[13-15],腫瘤細(xì)胞通過病原體持續(xù)性的中和抗原并突變,保持連續(xù)性感染,中和免疫機(jī)制的清除作用;病原體躲避在人體正常肺部細(xì)胞內(nèi)保持休眠,逃逸多重免疫機(jī)制的巡回監(jiān)視;病原體通過其本身的組成分子或分子結(jié)構(gòu)影響、阻止免疫機(jī)制的生成或者兩者保持拮抗?fàn)顟B(tài)。由此能夠增強(qiáng)患者自身免疫能力以及低不良反應(yīng)的新治療手段即免疫治療方法,進(jìn)入了肺癌治療領(lǐng)域。

    該研究原理為:T細(xì)胞在APC(抗原呈遞細(xì)胞)表面的共刺激分子作用下大量增殖,其中一部分分化為CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞),CTL與先前可識別的腫瘤細(xì)胞結(jié)合并將之殺傷裂解。T細(xì)胞增殖受T表面PD-1分子與APC細(xì)胞表面PD-L1控制,兩個共抑制分子結(jié)合抑制T細(xì)胞活化,控制免疫細(xì)胞增殖。而近些年研究發(fā)現(xiàn),PD-L1活躍表達(dá)于多種類實(shí)體腫瘤中:肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。所以腫瘤細(xì)胞表面PD-L1分子的高度表達(dá)與PD-1分子的大量結(jié)合會使特異性免疫細(xì)胞凋亡,影響T細(xì)胞增殖分化,導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。T細(xì)胞為殺滅腫瘤細(xì)胞的重要參與者,腫瘤細(xì)胞表面PD-L分子表達(dá)水平會影響T細(xì)胞的分化生成。所以通過本研究實(shí)驗觀察PD-L1在肺癌細(xì)胞株表面表達(dá)情況,以及其對T細(xì)胞的影響程度,從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

    綜上所述,PD-L1是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的重要影響因素之一,免疫治療可能是肺癌治療的有效可行方法。

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