弓形蟲ROP16Ⅱ效應(yīng)分子對(duì)宿主A549細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

， ,2， ，，，，,2

弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，全球平均感染率約為20%～30%，在我國(guó)的感染率約為5%～15%[1]。弓形蟲對(duì)腦組織具有很高的親嗜性。產(chǎn)前階段的弓形蟲感染是導(dǎo)致先天性弓形蟲病的常見(jiàn)原因。后天獲得性弓形蟲病多發(fā)生于腫瘤、HIV等患者，常引起腦炎、癲癇及精神分裂癥等神經(jīng)系統(tǒng)異常，除此之外亦可引起肺炎和心肌炎等[2-4]。腦外弓形蟲病中，肺弓形蟲病的發(fā)生率占第2或第3位，但目前關(guān)于肺弓形蟲病的報(bào)道較少[5]。

棒狀體蛋白(ROPs)作為弓形蟲的重要毒力因子，在弓形蟲入侵、增殖及毒力等方面起著關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ROPs有30多種，大多具有激酶、磷酸酶以及蛋白酶活性，主要定位于納蟲泡膜，納蟲泡及宿主細(xì)胞內(nèi)[6]。而ROP16非常罕見(jiàn)的特異性定位于人體細(xì)胞核內(nèi)[7-8]。ROP16是宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在絲氨酸蘇氨酸激酶區(qū)域，可參與宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)相關(guān)的磷酸化，從而干擾宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。不同弓形蟲株間的ROP16基因序列呈多態(tài)性，導(dǎo)致差異性的毒力表型[9-10]。II型弓形蟲(如Me49)多呈隱性感染，主要與人弓形蟲病的發(fā)生密切相關(guān)，其占艾滋病患者感染的65%[11]。因此，本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株為研究模型，建立了弓形蟲ROP16Ⅱ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)與分析，篩選差異表達(dá)基因，而后通過(guò)Toppgene生物信息學(xué)策略篩選II型弓形蟲病候選基因，以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因，對(duì)于更加全面地揭示II型弓形蟲病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 弓形蟲Me49株、E.coliDH5α及pEGFP-N1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；A549人肺腺癌細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))；DMEM(Hyclone公司，美國(guó))；Real time PCR 試劑盒(Takala，日本)；EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司，美國(guó))；cDNA第一鏈合成試劑盒、TransLipid Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自全式金公司；全基因組表達(dá)譜芯片采用Agilent人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549和HFF細(xì)胞均按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)，即復(fù)蘇后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)，2～4 d傳代一次。

1.2.2弓形蟲Me49株RNA的提取與cDNA的合成 Me49蟲株復(fù)蘇后接種于HFF細(xì)胞，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，800 g離心后取上清，12 000 g離心收集沉淀即為Me49蟲株。采用Trizol試劑反復(fù)吹打沉淀蟲體裂解，進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.3ROP16Ⅱ重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 Me49蟲株ROP16基因引物兩端同時(shí)包含EcoRⅠ，KpnⅠ酶切位點(diǎn)，上游序列：5′-CCGGAATTCTGATGAAAGTGACCACGAAAGGG-3′，下游序列：5′-CGGGTACCACATCCGATGTGAAGAAA-GTTC-3′。將PTEN PCR產(chǎn)物與pEGFP-N1載體質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收DNA凝膠，將回收的PCR酶切產(chǎn)物與pEGFP-N1質(zhì)?；旌虾筮M(jìn)行連接；而后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃ Kan抗性培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定并測(cè)序。取測(cè)序正確的菌液，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.2.4表達(dá)譜芯片以及數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Agilent人類4 × 44K基因表達(dá)微陣列v2芯片，樣品標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案執(zhí)行。使用Agilent Feature Extraction軟件處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。接著利用GeneSpring GX v12.1軟件進(jìn)行差異基因篩選，標(biāo)準(zhǔn)為FC值≥2.0。而后采用MAS 3.0系統(tǒng)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能分類注釋。本實(shí)驗(yàn)由上?？党缮镉邢薰就瓿?。

1.2.5Toppgene 篩選弓形蟲疾病候選基因Toppgene(http://toppgene.cchmc.org/)是一個(gè)有效而方便的基于基因功能相似性的候選基因篩選方法[12]。首先利用Genecards(http://www.genecards.org/)人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索所有已知和預(yù)測(cè)的“Toxoplasma”疾病基因，同時(shí)也采用OMIM(http://omim.org/)在線人類孟德?tīng)栠z傳搜索“Toxoplasma”已知的疾病基因。對(duì)兩數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索到的疾病基因進(jìn)行交集分析，將交集基因作為“訓(xùn)練基因集”，而以GeneSpring GX v12.1數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因作為“檢測(cè)基因集”，然后按Toppgene操作方法篩選出候選基因。

1.2.6熒光定量RT-qPCR 收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，分別提取pEGFP-N1-Me49 ROP16、pEGFP-N1及空A549細(xì)胞的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)IL12RB1，IL4R，IL2RG及STAT1的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-qPCR(PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃)，檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)根據(jù)2-△△Ct方法分析各組A549細(xì)胞中IL12RB1，IL4R，IL2RG及STAT1的mRNA表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列

Tab.1 The primers sequences used for RT-qPCR

基因上游引物序列(5'-3')下游引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小/bpIL12RB1CCTGGCACGGAGGTCACTTAACCCGAGAGATAGGGCATCTT108IL4RAACCCTGCTTACCGCAGCTTTCGGGTTCTACTTCCTCCAGGT107IL2RGTTCACGAACCCTACCAGTTTCTCATTACTTTGCTCCTCTCCCGACTAATC923STAT1AGGAAGCACCAGAGCCAATGAGCCCACTATCCGAGACACC168β-actinCACTGTGCCCATCTACGATGATGTCACGCACGATTT155

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1RNA質(zhì)量評(píng)估 提取的樣品總RNA 經(jīng)Nanodrop核酸測(cè)定儀檢測(cè)，其OD260/OD280比值均在1.8～2.0 之間；電泳后可以清晰地看到28 S和18 S兩條清晰條帶，且亮度比約為2∶1，5 S條帶不清晰，提示試驗(yàn)制備的 RNA 質(zhì)量良好，其純度、濃度和完整性均符合后續(xù)研究要求。

2.2差異表達(dá)基因的篩選 采用信號(hào)值比值法進(jìn)行差異基因篩選。圖中x軸表示原始質(zhì)粒樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，y軸則表示pEGFP-N1-Me49 ROP16轉(zhuǎn)染組樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值。圖中的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都表示芯片上的對(duì)應(yīng)的一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)，紅色為表達(dá)上調(diào)，綠色為表達(dá)下調(diào)。與原始質(zhì)粒pEGFP-N1-NC轉(zhuǎn)染組相比較，pEGFP-N1-Me49 ROP16轉(zhuǎn)染組呈現(xiàn)出差異性表達(dá)的 基因共有9 994個(gè)(t=10.507,P<0.05)，其中上調(diào)的基因有4 293個(gè)，下調(diào)的基因有5 701個(gè)(圖1)。在上調(diào)表達(dá)的差異基因分布中，差異倍數(shù)大于10的基因有45個(gè)(1.05%)；其中CMPK2表達(dá)量最大(24.03)，其次是IFITM1(23.22)，IFIT2(18.69)。而在下調(diào)表達(dá)的差異基因分布中，差異倍數(shù)小于-10的有427個(gè)(7.50%)，小于-30的有36個(gè)(0.63%)。具體見(jiàn)表2。

圖1 散點(diǎn)圖Fig.1 Log-log scatter plot

2.3GO富集分類 利用基因富集分析與 GO 分類標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)，分子功能(Molecular Function，MF)以及生物學(xué)過(guò)程(Biological Process，BP)3 個(gè)方面[13]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋分類，以分析差異基因主要影響的生物學(xué)通路和功能。結(jié)果顯示，GO 富集結(jié)果主要表現(xiàn)在BP和CC 兩大類。其中，對(duì)BP進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N1-Me49 ROP16細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響了多種生物學(xué)過(guò)程。對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的差異基因主要參與防御反應(yīng)、免疫應(yīng)答、生物調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及刺激反應(yīng)等方面。下調(diào)的差異基因則主要參與生物學(xué)過(guò)程、G-蛋白耦合受體信號(hào)通路、系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、生命發(fā)育、突觸傳導(dǎo)及感官知覺(jué)等方面，部分也與刺激反應(yīng)有關(guān)(圖4)。

表2 FC值(上調(diào)/下調(diào))表達(dá)量最大的部分基因

Tab.2 Representative list of(up-regulated/down-regulated)genes

編號(hào)上調(diào)基因上調(diào)倍數(shù)(FC)編號(hào)下調(diào)基因下調(diào)倍數(shù)(FC)1CMPK224.0331OR51G2-126.1212IFITM123.2212KCNH7-105.3473IFIT218.6913GIGYF1-94.8764RSAD217.4724OTOF-87.7295IL2917.1815RECQL-70.3176CH25H16.8436C5orf58-63.3827LOC73245516.2337VRK1-55.9178BATF216.0168CRIM1-52.0869LOC34051215.8419PRRT1-46.56210IFI4415.68410ICMT-46.14311TRIM2215.51211CKLF-45.72312IFITM114.35512LOC153811-43.65613IFIT213.86913ADAMTSL3-42.98714RP11-218C14.613.80514CLN8-40.56515C20orf12313.63615LOC339742-39.13016OAS213.17616DAGLA-38.35717IFIT313.10017AIF1L-38.11318CCBE112.54218PAPL-37.52019IL28B12.47619LOC100130152-36.79720SLC16A1212.45420LOC100289004-35.645

圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分析BPFig.2 Enriched GO terms of differentially expressed genes in terms of biological process

圖3 GeneCards和 OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的弓形蟲疾病訓(xùn)練基因Fig.3 Training gene set for ToppGene derived from GeneCards and OMIM databases

2.4篩選II型弓形蟲病候選基因 以“Toxoplasma”作為搜索詞，在Genecards中搜素已知的弓形蟲疾病基因，共獲得191條gene card 記錄。通過(guò)OMIM查詢“Toxoplasma”疾病基因，共獲得39條弓形蟲相關(guān)疾病基因。對(duì)兩種方法獲得的疾病基因進(jìn)行交集分析，最終獲得9個(gè)已知的弓形蟲病相關(guān)基因，如圖3所示。隨后，將這9個(gè)基因作為“訓(xùn)練基因集”，而以差異表達(dá)基因作為“檢測(cè)基因集”，采用Toppgene和ToppNet方法對(duì)候選基因集進(jìn)行優(yōu)化排序，以期篩選II型弓形蟲病候選基因。表3顯示通過(guò)Toppgene和ToppNet方法篩選出的前30個(gè)II型弓形蟲病候選基因。通過(guò)對(duì)兩種方法獲得的候選基因進(jìn)行交集分析，發(fā)現(xiàn)Toppgene和ToppNet方法同時(shí)篩選出了IL12RB1，IL4R，IL2RG及STAT1這4個(gè)基因。

表3 前30個(gè)Toppgene篩選的II型弓形蟲病候選基因

Tab.3 Top 30 candidate genes of ToppGene for type II T. gondii

ToppGeneToppNet編號(hào)基因名稱平均得分(×10-1)總體P值(×10-4)編號(hào)基因名稱互相作用基因數(shù)得分(×10-4)1HLA-DRB19.8130.31021CCR32036.042IL69.4150.42852IL12RB12131.823FAS9.4510.53903TERF2IP15330.314RYR17.8590.54144IL12RB2523.865FASLG9.6300.74005ERP447523.016CD40LG9.6460.81776ELAVL1177122.597CD409.0661.2257IL4R4619.318IFNG9.3261.3498H3F3A14718.089SYNE26.6681.6439NFATC114917.1110HLA-A8.9921.75010IL2RG3316.8711TNFRSF1A9.3131.77611A2M11916.8012ACE9.3741.80312CD53915.6813B2M8.8441.94713GATA33115.6614IL12RB19.2821.95614CCL54113.3715IL2RG9.6102.10715CCR54411.6716HLA-DQA19.6242.22016MOV10101010.2217NPNT6.9352.25417STAT11949.70718PTPRC9.2902.35718CCL899.51919IL4R9.0932.91619CCL4119.19520CXCR49.5063.06420ESR17668.84421MYH116.6073.16921CCL3138.77222NOD29.2963.46122CCL14137.84723HLA-DR9.7653.51623CCL3L347.54224IL6ST9.6583.98024ITGA45196.89825CD278.4344.21125SMURF13976.71326KRAS9.0274.27826STAT4166.68127FCGR3A9.0784.54927CCL1656.62128STAT18.3104.76928CAND17006.59729CTLA49.0635.02229HNRNPA15286.37230CD198.2585.14230PAG1445.999

2.5RT-qPCR驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證Toppgene所篩選的基因，本研究采用RT-qPCR對(duì)IL12RB1，IL4R，IL2RG及STAT1這4個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管RT-qPCR所驗(yàn)證的基因的變化倍數(shù)與表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果不完全相同，但變化方向一致，即pEGFP-N1-Me49 ROP16轉(zhuǎn)染組中IL12RB1與IL2RG表達(dá)下調(diào)，而IL4R與STAT1表達(dá)上調(diào)(圖4)。

圖4 RT-qPCR對(duì)表達(dá)譜芯片結(jié)果的驗(yàn)證Fig.4 Validation of the microarray results by RT-qPCR

3 討 論

基因芯片技術(shù)作為一種高通量、高效能的篩選工具，在大規(guī)模獲取生物信息的同時(shí)， 產(chǎn)生了海量的數(shù)據(jù)，不能提供足夠特異的疾病基因信息[14]。因此，結(jié)合多種生物信息學(xué)工具進(jìn)一步有效、深入地挖掘是十分有必要的。Toppgene 作為一種基于基因功能相似性的方法近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于疾病基因的發(fā)現(xiàn)，其能夠從GO 注釋、通路、疾病、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白相互作用等方面對(duì)基因進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，具有高通量、重復(fù)性好及快速的優(yōu)勢(shì)[12,15]。在此背景下，本研究運(yùn)用了基因芯片技術(shù)結(jié)合 Toppgene 生物信息學(xué)策略進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析。

通過(guò)在人肺腺癌A549細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá) ROP16Ⅱ后發(fā)現(xiàn)，ROP16Ⅱ在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后共產(chǎn)生了9 994個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因有4 293個(gè)，下調(diào)的基因有5 701個(gè)。在上調(diào)表達(dá)差異的基因分布中，CMPK2表達(dá)量最大，其次是 IFITM1和IFIT2。研究發(fā)現(xiàn)，IFITM1是控制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因子。其與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)，由IFN刺激誘導(dǎo)分泌產(chǎn)生，在STAT1和p53兩個(gè)信號(hào)介質(zhì)間提供交互作用。此外，IFITM1蛋白參與同型黏附和抗增生信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，與免疫監(jiān)視、抗病毒及抗腫瘤等相關(guān)[16-17]。IFIT2作為IFITs家族一員，在正常生理情況下基本不表達(dá)。但當(dāng)病毒感染、微生物等誘導(dǎo)情況下，IFIT2會(huì)快速大量表達(dá)。IFIT2在激活I(lǐng)FN信號(hào)、促細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。

生物學(xué)功能富集分析可以發(fā)現(xiàn)ROP16Ⅱ涉及到的特定生物學(xué)過(guò)程。本研究表明，A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒ROP16Ⅱ后影響了多種生物學(xué)過(guò)程，這些生物學(xué)過(guò)程涉及了細(xì)胞內(nèi)重要的生命活動(dòng)。其中，上調(diào)的差異基因主要富集在免疫方面，如免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)等方面。而下調(diào)的差異基因則主要富集在生物學(xué)過(guò)程、G-蛋白耦合受體信號(hào)通路及神經(jīng)發(fā)育等方面。

另外，在本研究中我們聯(lián)合應(yīng)用 Genecards和 OMIM兩種文獻(xiàn)挖掘工具，建立了一個(gè)包含9個(gè)已知的弓形蟲病相關(guān)基因的“訓(xùn)練基因集”(CCR1，STAT6，MYD88，TNF，CXCL10，IDO1，IL4，IL12B及 ALOX5)，并應(yīng)用此“訓(xùn)練基因集”結(jié)合 Toppgene工具最終篩選到 4個(gè)致病候選基因。在這4個(gè)候選基因中，IL12RB1和 IL2RG 基因表達(dá)下調(diào)。IL12RB1 基因編碼的 IL12受體β1與低親和性的 IL12結(jié)合，參與 IL12轉(zhuǎn)導(dǎo)；與 IL12RB2相關(guān)聯(lián)，可導(dǎo)致高親和性 IL12結(jié)合位點(diǎn)的形成和 IL12依賴性信號(hào)的重構(gòu)。另外，IL12RB1與 IL23R結(jié)合，可形成 IL23受體復(fù)合物[19]。IL23在多種感染中都發(fā)揮著重要的作用，是 Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。IL2RG是細(xì)胞因子 IL2，IL4，IL7及 IL21等傳遞信號(hào)所共同需要的受體成分[20]。而上調(diào)的 IL4R 基因編碼了 IL4受體的α鏈。一方面，IL4受體可以結(jié)合 IL4和 IL13來(lái)調(diào)節(jié) IgE的生成。另一方面，IL4受體也可以結(jié)合 IL4，促進(jìn) Th2細(xì)胞的分化[21]。此外，ROP16Ⅱ也可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞高表達(dá)STAT1。STAT1是先天性免疫所必需的，具有抗感染及抑制細(xì)胞增殖的作用，可參與細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程。STAT1在對(duì)細(xì)菌、寄生蟲及病毒的免疫調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)病原微生物的易感性。STAT1與Th1應(yīng)答有關(guān)，參與大部分 MHC 對(duì)抗原肽的呈遞過(guò)程。STAT1 通過(guò)調(diào)控 IL27 的表達(dá)，可誘導(dǎo) B 細(xì)胞早期成熟。STAT1 可直接誘導(dǎo)T-bet蛋白的表達(dá)，激活免疫球蛋白[22]。此外，Lieberman 等研究表明，在弓形蟲病中，STAT1的主要作用不是保護(hù)T細(xì)胞的反應(yīng)，而是在 MHC上調(diào)表達(dá)、產(chǎn)生足夠的 NO、IFN 誘導(dǎo)的 GTPase 家族的部分蛋白上調(diào)表達(dá)、T-bet上調(diào)表達(dá)等抗蟲效應(yīng)機(jī)制中起重要作用[23]。

綜上所述，ROP16Ⅱ影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜，IL12RB1，IL4R，IL2RG及STAT1這4個(gè)免疫調(diào)控相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于深入理解ROP16在蟲體與宿主細(xì)胞間的相互作用，以及致病的分子機(jī)制具有重要意義。

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