IL-33敲除促進(jìn)弓形蟲感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的M1偏移

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弓形蟲是一種專性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可以感染幾乎所有的溫血動物，呈全球性分布。弓形蟲感染可導(dǎo)致人和其它哺乳動物流產(chǎn)，是人先天致畸的重要病原體，也是引起免疫缺陷疾病如AIDS和長期使用免疫抑制劑病人死亡的重要原因[1-2]。

白介素-33(interleukin-33, IL-33)是2005年作為磺基轉(zhuǎn)移酶同源體(homolog of sulfotransferase, ST2)的配體被發(fā)現(xiàn)的一個新的IL-1家族成員。ST2選擇性地在Th2細(xì)胞上表達(dá)，Th1則不表達(dá)，IL-33與ST2結(jié)合，通過下游信號分子髓樣分化因子88(MyD88)，IL-1相關(guān)蛋白激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6(TRAF6)，使NF-κB 和MAPK活化，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生及發(fā)揮后續(xù)的生物學(xué)功能[3]，故IL-33可增強(qiáng)Th2免疫反應(yīng)。同時，IL-33也是Th2細(xì)胞的趨化因子，促使Th2細(xì)胞在淋巴結(jié)和組織中募集，通過促進(jìn)Th2免疫反應(yīng)、趨化嗜酸粒細(xì)胞、改變Mφ 的極化趨勢，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用，如感染性疾病、過敏性疾病、自身免疫性疾病等[3-6]。

巨噬細(xì)胞(macrophage, Mφ)是一種多分化來源的細(xì)胞，具有復(fù)雜的異質(zhì)性與功能的多樣性，在不同的微環(huán)境及不同的因子作用下可被激活成不同的表型，根據(jù)極化后細(xì)胞表面標(biāo)志性分子及功能的不同，Mφ大體可分為經(jīng)典激活的Mφ(Ml型)和替代激活的Mφ(M2型)。M1型細(xì)胞以CD68+、CD86+、MHCⅡ+為表型特征，表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)，IL-12及膜蛋白CD16/32；通過產(chǎn)生iNOS分解L-精氨酸產(chǎn)生NO及反應(yīng)性氧中間物(ROI)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及清除入侵微生物；高效遞呈抗原、高水平合成促炎細(xì)胞因子，是激活Thl細(xì)胞反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，具有抗病原微生物和腫瘤細(xì)胞的作用[7-9]。而M2型細(xì)胞則通過表達(dá)I型精氨酸酶(Arginase1，Arg1)分解L-精氨酸產(chǎn)生L-鳥氨酸，L-鳥氨酸是脯氨酸前體，能促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)損傷部位的修復(fù)；低表達(dá)IL-12，高表達(dá)IL-10、Arg1、甘露糖受體(CD206)、YM-1(幾丁質(zhì)酶家族成員)等；抗原遞呈功能弱，通過抑制Thl免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞，抑制急性炎癥反應(yīng)、參與慢性炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、超敏反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合等的發(fā)生和發(fā)展、促進(jìn)損傷組織修復(fù)、重構(gòu)和血管生長功能。iNOs和Arg1兩者競爭性地結(jié)合L-精氨酸，并通過代謝產(chǎn)物發(fā)揮促炎或抗炎的相反作用[10-14]。

近期的研究表明，IL-33可促進(jìn)Mφ 向M2方向極化，在Mφ 的極化中發(fā)揮重要作用。在IL-33誘導(dǎo)的氣道炎癥中，IL-33促進(jìn)靜止?fàn)顟B(tài)的肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)向M2方向極化，表達(dá)CD206，IL-4Rα，產(chǎn)生高水平的CCL24和CCL17，去除AMs會減輕氣道炎癥反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)也顯示，IL-13/IL-4Rα 信號通路在IL-33驅(qū)使AMs向M2a方向極化中起關(guān)鍵作用，IL-33放大了IL-13誘導(dǎo)的肺泡及骨髓來源的Mφ 向M2a方向極化，增加Arg-1，YM-1及CCL24和CCL17的表達(dá)。在先天性及抗原誘導(dǎo)性的氣道反應(yīng)性炎癥中，IL-33/ST2在AMs向M2a極化中起重要作用[13]。Yang Z等的研究也證實(shí)IL-33誘導(dǎo)AMs主要是通過AAM自分泌IL-13激活I(lǐng)L-4Rα-STAT6途徑，Mφ 作為IL-25/IL-33的效應(yīng)細(xì)胞在Th2型免疫反應(yīng)中起重要作用。去除小鼠Mφ 會減弱IL-25/IL-33誘導(dǎo)的2型免疫反應(yīng)[15]。Besnard A-G等在研究小鼠實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾(ECM)時也證實(shí)：IL-33通過促進(jìn)Th2型的先天性淋巴細(xì)胞(ILC2)產(chǎn)生2型的細(xì)胞因子，如IL-4，IL-5，IL-13，從而驅(qū)使Mφ 向M2型極化，而M2型細(xì)胞再影響Tregs，最終抑制Th1免疫反應(yīng)，減少IFN-γ，IL-12 和TNF-α 的分泌，抑制ECM的進(jìn)一步發(fā)展[16]。最新研究也顯示IL-33在柯薩奇病毒引起的心肌炎[5]和三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的腸炎[6]中通過誘導(dǎo)Mφ 向M2方向極化從而減輕炎癥發(fā)展。

綜上所述，可見IL-33在Mφ 的極化中起重要作用，關(guān)于其在弓形蟲感染Mφ 中的免疫作用還未見報道。因此本課題通過觀察IL-33-/-小鼠PMφ 弓形蟲感染后的極化趨勢，進(jìn)一步探討IL-33在弓形蟲感染免疫應(yīng)答中的作用。

1 材料與方法

1.1蟲株 ZS株剛地弓形蟲(人源),基因型為ToxoDB#9 (Chinese 1)，由本室傳代保種。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雌性C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠各48只，鼠齡12～14周，體重22～25 g，昆明鼠30只。C57BL/6 WT小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[許可證號碼：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號：20150 00509916，2015000518671]，C57BL/6 IL-33-/-小鼠由福建中醫(yī)藥大學(xué)林煒教授提供，和昆明鼠小鼠一起飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(閩)2012-0001，適用范圍：SPF 級鼠類),動物房SPF層流柜中，鼠籠、鼠料、墊料、飲水經(jīng)過高壓消毒滅菌，每周墊料更換兩次，動物使用協(xié)議由動物審查委員會批準(zhǔn)。

1.3試劑及儀器 吉姆薩染液(北京中杉金橋生物有限公司)；引物(上海生工)；PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD80，PE anti-Mouse TLR4，PE-anti-Mouse MHCⅡ，F(xiàn)ITC-anti-mouse CD14，F(xiàn)ITC-anti-mouse TLR2，Rat IgG2b，κIsotype Ctrl PE/ Rat IgG2a，κIsotype Ctrl APC(美國eBiosciences)；APC anti-mouse CD206，Rat IgG2b，κIsotype Ctrl PE，APC anti-mouse CD86(美國Biolegend)；RPMI 1640 培養(yǎng)液(美國Hyclone)；胎牛血清(美國Gibco)；Mouse IL-10，IL-12，TNF-α ELISA kit (杭州聯(lián)科生物)；Griess Reagent System (美國Promega)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國 Fermentas)；SYBR Green Master(美國Roche)；溫度梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R(香港Heal Force Development Ltd)；酶標(biāo)儀Multiscan FC、CO2培養(yǎng)箱Thermo Forma 3111型(美國Thermo Fisher)；Mx3005p實(shí)時熒光定量PCR儀ND2000C(美國StrataGene)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；超凈臺(蘇州蘇凈安泰)；超低溫冰箱(英國NBS)。

1.4 方法

1.4.1小鼠基因型鑒定 采用Keisuke Oboki[17]設(shè)計(jì)的引物，由上海生物工程公司合成(表1)，提取小鼠鼠尾 DNA，PCR鑒定小鼠基因型。

1.4.2小鼠pMφ弓形蟲感染率測定 參照文獻(xiàn)[18]收集12～14周左右的 C57BL/6 WT 及 IL-33-/-小鼠 pMφ，每組6只，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL，以0.5 mL/孔接種于放了爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，去除未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮的0.5 mL 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入0.5 mL 培養(yǎng)液稀釋的2.5×106個/mL弓形蟲速殖子(液氮復(fù)蘇后傳3代以上)，輕輕混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)30 min；棄培養(yǎng)上清液，加入 PBS 洗滌1次，冷風(fēng)吹干，加入0.5 mL 的甲醇固定3 min，吸棄殘余的甲醇溶液，加入姬姆薩染液0.5 mL 染色30 min，用蒸餾水洗滌2次，吹干爬片，用中性樹脂固定于載玻片上，高倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個細(xì)胞的感染率。

表1 C57B/L WT及IL-33-/-小鼠基因型鑒定引物

Tab.1 Primer sequences for genotyping

片段引物長度/bpWTex2-F:5'-CACTAAGACTACTCAGC-CTCAG489WT-R:5'-CGGTGATGATGCTGTG-AAGTCTGIL-33-/-ex2-F:5'-CACTAAGACTACTCAGC-CTCAG834KO-R:5'-GTGTTCTGCTGGTAGT-GGTCG

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)和弓形蟲感染方法 實(shí)驗(yàn)分4組，分別為 IL-33-/-小鼠 pMφ 弓形蟲感染組和未感染組，WT 小鼠 pMφ 弓形蟲感染組和未感染組。收集 WT 和IL-33-/-小鼠 pMφ，每組各6只，按5×105細(xì)胞/孔，復(fù)孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；洗去未貼壁細(xì)胞，加入0.5 mL新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取復(fù)孔中的一孔為感染孔，加入弓形蟲速殖子1.2×105個/mL，0.5 mL/孔；另一孔為未感染孔加入0.5 mL 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸取培養(yǎng)上清液離心分裝凍存于-70 ℃用于NO、TNF-α、IL-10、IL-12 的檢測；收集細(xì)胞進(jìn)行 Real-time PCR 和流式檢測。

1.4.4Real-time PCR檢測弓形蟲感染前后pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA的表達(dá) 取感染24 h后收集的各組細(xì)胞，經(jīng)Trizol 裂解、提取RNA、OD260/280測定其濃度和純度；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，采用20 μL 反應(yīng)體系；按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)說明書進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參檢測 iNOS、Arg-1、IL-1、IL-4、IL-10、IL-12 mRNA相對表達(dá)量，引物見表2；PCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min→95 ℃ 預(yù)變性10 min→(95 ℃變性15 s，60℃退火1 min→40個循環(huán)體系)→95 ℃ 15 s →60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，用△Ct法進(jìn)行計(jì)算：△Ct=Ct目的基因-Ct參照基因，△△Ct= (Ct目的基因-Ct參照基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct參照基因)對照組，2-△△Ct的意義即實(shí)驗(yàn)組目的基因相對于對照組目的基因表達(dá)量變化倍數(shù)，野生型小鼠未感染組為對照組。

表2 Real-time PCR 引物表

Tab.2 Primer sequences for real-time PCR

片段正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')IL-1βGGAAGGTCCACGGGAAAGACAGGCAGGCAGTATCACTCATTGTiNOSGAGTGACGGCAAACATGACTTCGCCATCGGGCATCTGGTAIL-12CACCCTTGCCCTCCTAAACCACACCTGGCAGGTCCAGAGAIL-10CAGCCGGGAAGACAATAACTGCGCAGCTCTAGGAGCATGTGArg-1GCTCCAAGCCAAAGTCCTTAGACCTCGAGGCTGTCCTTTTGAβ-actinTGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG

注：iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶；Arg-1：1型精氨酸酶。

1.4.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組pMφ 弓形蟲感染后TNF-α、IL-10、IL-12的分泌水平 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.6Griess方法檢測弓形蟲感染前后各組pMφ NO的分泌水平 按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.7流式細(xì)胞術(shù)檢測弓形蟲感染前后各組 pMφ 表面分子(CD80、CD86、CD206、TLR4、TLR2、MHCⅡ)的表達(dá)水平 胰酶消化收集各組細(xì)胞，洗滌后，加入含封閉抗體(CD16/32)的細(xì)胞洗液80 μL，混勻，冰浴10 min；加入各管相應(yīng)的 Ab(CD80/CD206/TLR4；CD86/MHCⅡ/TLR2)20 μL，漩渦混勻，4 ℃，避光35 min；加入含1%多聚甲醛的 PBS 固定液0.5 mL，上流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1小鼠基因型的鑒定 以PCR鑒定本實(shí)驗(yàn)用小鼠為C57BL/6 WT 和IL-33-/-小鼠。

2.2小鼠pMφ 純度鑒定 FITC-CD14染色檢測純度為95%左右(圖1)。

圖1 小鼠pMφ鑒定(左)及同型對照(右)Fig.1 Identification of pMφ

2.3小鼠pMφ 感染率比較 C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠pMφ 感染弓形蟲速殖子30 min后，IL-33-/-小鼠pMφ 感染率低于WT小鼠(數(shù)值分別為0.95±0.01及0.98±0.01，t=-2.49,P<0.05)，提示IL-33-/-小鼠pMφ 抗弓形蟲感染能力增強(qiáng)。

2.4IL-33-/-和弓形蟲感染對小鼠pMφ M1型標(biāo)志物表達(dá)的影響

2.4.1IL-33-/-對pMφ M1型標(biāo)志物表達(dá)的影響 IL-33-/-感染組pMφ 上清液中NO的濃度(F=29.71,P<0.05)及細(xì)胞表面MHCⅡ(F=19.05,P<0.05)、TLR4(F=8.34,P<0.05)陽性百分率高于WT感染組，提示IL-33-/-促進(jìn)弓形蟲感染的小鼠pMφ 分泌NO，表達(dá)MHCⅡ和TLR4分子；而TLR2陽性百分率表達(dá)則相反(F=14.88,P<0.01)，提示IL-33-/-抑制了pMφ TLR2的表達(dá)；IL-33-/-小鼠感染組pMφ iNOS(F=0.96,P<0.01)、IL-1(F=0.83,P<0.01)、IL-12 mRNA(F=1.32,P<0.01)的表達(dá)，TNF-α 的分泌(F=0.98,P>0.05)及表面分子CD80(F=0.23,P>0.05)、CD86的表達(dá)(F=0.02,P>0.05)與WT小鼠感染組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

2.4.2弓形蟲感染對小鼠pMφ M1型標(biāo)志物表達(dá)的影響 IL-33-/-和WT小鼠感染組pMφ TNF-α(F=11.56,P>0.05)、NO分泌水平(F=16.68,P>0.05)及CD86(F=13.43,P>0.05)、TLR4(F=57.57,P>0.05)、MHCⅡ(F=34.34,P>0.05)表面分子的表達(dá)均高于各自未感染對照組，提示感染促進(jìn)了IL-33-/-和WT小鼠pMφ 上述炎性介質(zhì)及表面分子的表達(dá)；弓形蟲感染對IL-33-/-和WT小鼠pMφ iNOS(F=0.69,P>0.05)、IL-1(F=0.02,P>0.05)、IL-12 mRNA(F=2.46,P>0.05)表達(dá)及表面分子CD80(F=1.87,P>0.05)、TLR2(F=3.33,P>0.05)表達(dá)的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

表3 pMφ M1型標(biāo)志物檢測結(jié)果比較

Tab.3 Expression of pMφ M1 marks

M1標(biāo)志物No.IL-33-/-感染組IL-33-/-空白組WT感染組WT空白組mRNA表達(dá)IL-160.75±0.310.90±0.370.78±0.320.52±0.21(2-△△CT)iNOS63.80±1.556.77±2.771.98±0.813.63±1.48IL-1262.20±0.901.62±0.660.61±0.270.51±0.23分泌濃度IL-1210未檢出未檢出未檢出未檢出(pg/mL)TNF-α101732.49±325.17**1602.31±247.941488.35±757.99**1324.04±623.64NO(μmol/L)1031.62±14.47**b28.46±12.6015.77±9.16**11.94±9.62表面分子表達(dá)CD80678.72±12.2270.75±15.0277.74±8.2477.90±8.98(%)CD86690.53±6.67**61.69±8.0850.49±22.99**37.86±12.74TLR461.84±0.43**a1.26±0.571.06±0.27**0.63±0.28TLR2654.44±9.88b57.75±10.4964.20±17.7742.29±0.23MHCⅡ658.07±10.76**b53.97±13.8343.20±13.73**34.99±11.20

注：與各自未感染對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與WT感染組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.4.3IL-33-/-和弓形蟲感染雙因素對小鼠pMφ M1型標(biāo)志物表達(dá)的影響 IL-33-/-和感染雙因素對小鼠pMφ MHCⅡ分的表達(dá)有交互促進(jìn)作用(F=5.25,P<0.05，圖2)，而對TLR2的表達(dá)則是明顯的交互抑制作用(F=14.88,P<0.01，圖3)，提示IL-33-/-促進(jìn)弓形蟲感染的小鼠pMφ 表達(dá)MHCⅡ分子，而抑制TLR2的表達(dá)。 IL-33-/-和感染雙因素對IL-33-/-小鼠與WT小鼠間iNOS、IL-1、IL-12mRNA、TNF-α、NO、CD80、CD86、TLR4的表達(dá)無交互影響。

圖2 IL-33敲除與感染對小鼠 pMφ MHCⅡ表達(dá)的交互作用Fig.2 Interaction of IL-33 knockout and infection on the expression of MHCⅡon pMφ

圖3 IL-33敲除與感染對小鼠 pMφ TLR2表達(dá)的交互作用Fig.3 Interaction of IL-33 knockout and infection on the expression of TLR2 on pMφ

2.5IL-33-/-和弓形蟲感染對小鼠pMφ M2型標(biāo)志物表達(dá)的影響 與WT感染組比較，IL-33-/-感染組小鼠pMφ CD206的表達(dá)降低(t=-3.34,P<0.01)；而弓形蟲感染促進(jìn)了WT和IL-33-/-小鼠pMφ IL-10的分泌(F=6.18，P<0.05)；IL-33-/-和感染雙因素對小鼠pMφ Arg-1、IL-10 mRNA、CD206、IL-10的表達(dá)無交互作用，見表4。

表4 pMφ M2型標(biāo)志物檢測結(jié)果比較

Tab.4 Expression of pMφ M2 marks

M2標(biāo)志物No.IL-33-/-感染組IL-33-/-空白組WT感染組WT空白組IL-10(2-△△CT)61.45±0.592.09±0.852.34±0.951.44±0.596Arg-1(2-△△CT)60.64±0.261.10±0.450.82±0.330.45±0.18IL-10(pg/mL)106229.70±3673.16*5811.18±3484.134637.62±1645.85*4395.06±1469.16CD206(%)612.00±3.88**12.03±2.9614.96±2.5617.38±6.41

注：與各自未感染對照組比較，*P<0.05；與WT感染組比較，**P<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。

3 討 論

弓形蟲感染pMφ 后，會劫持宿主細(xì)胞器進(jìn)行繁殖[19]，最終導(dǎo)致大量宿主細(xì)胞裂解破碎。本實(shí)驗(yàn)弓形蟲感染pMφ 30 min后IL-33-/-小鼠pMφ 胞內(nèi)速殖子的數(shù)量少于WT小鼠，提示IL-33-/-小鼠pMφ 與WT小鼠比較，抗弓形蟲感染的能力增強(qiáng)。因此，本研究于弓形蟲感染小鼠pMφ 24 h后同時檢測pMφ mRNA的表達(dá)水平、細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的分泌水平、細(xì)胞表面標(biāo)志性分子的表達(dá)水平，以達(dá)到比較客觀的觀察在IL-33-/-與弓形蟲感染雙因素作用下小鼠pMφ 的變化。IL-33-/-小鼠感染組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO明顯升高(F=16.68，P<0.01)，提示感染早期IL-33-/-促進(jìn)pMφ 生成NO，后者可與Mφ 氧化酶所產(chǎn)生的過氧化氫或過氧化物結(jié)合，產(chǎn)生殺傷微生物的過亞硝酸鹽基[18,20]。弓形蟲感染明顯促進(jìn)了感染組小鼠pMφ NO及TNF-α 的分泌，提示弓形蟲感染增強(qiáng)了小鼠pMφ 的抗炎活性。而Real-time PCR檢測弓形蟲感染后小鼠pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA表達(dá)水平顯示，IL-33-/-和感染對各個指標(biāo)mRNA表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和IL-10含量明顯升高的變化，可能與檢測的時間點(diǎn)滯后有關(guān)系。

弓形蟲蛋白會抑制 γ-干擾素激活的Mφ 表達(dá)MHCⅡ類分子[21-22]，而在本次研究中卻觀察到感染組小鼠pMφ 表面MHCⅡ類分子表達(dá)明顯高于未感染對照組，分析結(jié)果顯示：IL-33-/-小鼠pMφ弓形蟲感染后MHCⅡ類分子的表達(dá)高于WT型感染組。同時，感染組小鼠pMφ CD86分子也明顯高于未感染對照組。MHCⅡ類分子為激活CD4+T細(xì)胞提供第一信號，而CD86是CD28的配體，提供T細(xì)胞激活的共刺激信號。感染組小鼠pMφ 表面MHCⅡ類分子和CD86分子表達(dá)增高，提示弓形蟲感染可能增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞激活的雙信號，促進(jìn) T細(xì)胞的生長和分化。由于弓形蟲為胞內(nèi)寄生原蟲，細(xì)胞免疫在整個抗弓形蟲感染過程中發(fā)揮了極其重要的作用。CD4+T細(xì)胞在抗弓形蟲感染中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，而CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用[18]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)急性弓形蟲感染時WT小鼠CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例逐漸降低，隨著感染進(jìn)展CD8+T細(xì)胞在數(shù)量上比CD4+T細(xì)胞占優(yōu)勢。而IL-33-/-小鼠則剛好相反。這一點(diǎn)和文獻(xiàn)報道的弓形蟲腦炎時NF-κB-/-小鼠腦中CD8+T細(xì)胞數(shù)量少于野生型小鼠相符[23]。因此IL-33-/-可能通過促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞CD86、MHCⅡ類分子的表達(dá)促進(jìn)CD4+T細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

Toll樣受體是一類跨膜受體，可識別并結(jié)合相應(yīng)的病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)，在弓形蟲感染中主要通過啟動TLR/MyD88信號傳導(dǎo)途徑[24]，誘導(dǎo)某些炎癥介質(zhì)(如細(xì)胞因子)和某些殺菌分子(如NO等)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)并發(fā)揮殺寄生蟲作用[25-26]。弓形蟲糖基磷脂酰肌醇類(GPIs)可活化TLR2和TLR4[24]。我們發(fā)現(xiàn)感染組小鼠pMφ TLR4表達(dá)明顯高于對照組，IL-33-/-促進(jìn)了小鼠pMφ TLR4的表達(dá)。但在本次實(shí)驗(yàn)中，IL-33-/-小鼠感染組pMφ TLR2的表達(dá)明顯低于WT感染組。Mun HS等觀察到TLR2敲除小鼠口服感染弓形蟲無毒株包囊后8 d內(nèi)全部死亡，而TLR4敲除小鼠及野生型小鼠則全部存活；發(fā)現(xiàn)TLR2敲除小鼠 pMφ 感染弓形蟲后未能產(chǎn)生NO和 γ-干擾素等抗弓形蟲感染的炎性介質(zhì)[27]。本實(shí)驗(yàn) IL-33-/-小鼠pMφ 感染弓形蟲后表面受體TLR2表達(dá)降低是否與受體內(nèi)化有關(guān)還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，在急性弓形蟲感染早期，IL-33-/-小鼠pMφ 高表達(dá)MHCⅡ類分子、NO、TLR4、CD86等M1型標(biāo)志，而M2型標(biāo)志物CD206表達(dá)降低。提示IL-33-/-可能通過調(diào)控Mφ 向M1亞群分化，分泌NO等活性介質(zhì)，表達(dá)MHCⅡ類分子、CD86等分子參與抗弓形蟲免疫應(yīng)答。

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