埃茲蛋白通過(guò)L1細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移*

馮 輝，金明根，金鐵峰

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)腫瘤研究中心，吉林延吉 133002)

在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率及病死率居于各類(lèi)惡性腫瘤的首位[1-2]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埃茲蛋白(Ezrin)在非小細(xì)胞肺癌組織中明顯高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后呈正相關(guān)[3-5]。L1細(xì)胞黏附分子(L1-cell adhesion molecule,L1CAM)可以使細(xì)胞間黏附性喪失，現(xiàn)已證實(shí)其與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。最新的研究證實(shí)Ezrin可與L1CAM緊密結(jié)合行使重要功能[9]，但其具體機(jī)制不詳。本研究旨在探討Ezrin通過(guò)調(diào)控L1CAM的表達(dá)促進(jìn)肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床診治肺癌提供新的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細(xì)胞系人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞H460、人肺鱗癌細(xì)胞EBC-1、人肺腺癌細(xì)胞A549、人肺腺癌細(xì)胞PC9、人肺腺癌細(xì)胞H1299、人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞95D等(美國(guó)ATCC公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Santa Cruz 公司)；鼠抗人Ezrin及L1CAM抗體(美國(guó)Abcam公司)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 試驗(yàn)選取肺癌細(xì)胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D等細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，3 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細(xì)胞Ezrin的表達(dá) 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，以Triozol充分裂解細(xì)胞后，加入氯仿震蕩，加入異丙醇靜置，反應(yīng)溫度為95 ℃變性，58 ℃退火，72 ℃延伸。行凝膠電泳，最終置于凝膠成像儀分析結(jié)果，分析各細(xì)胞系Ezrin的表達(dá)水平。Ezrin引物序列：上游5′-TGGAGTTGATGCCCTTGGAC-3′;下游 5′-AGTCAGGTGCCTTCTTGTC-3′。

1.2.3Westem blot檢測(cè) 通過(guò)Western blot 檢測(cè)肺癌細(xì)胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細(xì)胞Ezrin蛋白的表達(dá)，將上述細(xì)胞系以冷PBS洗2次后提取總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測(cè)定蛋白濃度，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳垂直電泳進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下?lián)u床封閉[Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)+5%脫脂奶粉]2 h，加入一抗，4 ℃過(guò)夜。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶二抗，孵育2 h。ECL曝光，觀察并拍照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4應(yīng)用siRNA沉默高轉(zhuǎn)移肺癌95D細(xì)胞系Ezrin的表達(dá) 應(yīng)用Ezrin小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA，由廣州銳博公司構(gòu)建)沉默肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系95D的Ezrin的表達(dá)。Ezrin siRNA-1正義鏈：5′-AAGGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTUUCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。Ezrin siRNA-2正義鏈：5′-GGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。選取Ezrin沉默效率更高的Ezrin siRNA-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。通過(guò)Western blot檢測(cè)沉默有效性。

1.2.5劃痕試驗(yàn) 應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)比肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系95D細(xì)胞和Ezrin沉默后95D細(xì)胞(siEzrin-95D)的遷移能力 將5×105個(gè)細(xì)胞(95D細(xì)胞和siEzrin-95D細(xì)胞)接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%，用移液槍槍頭在單層細(xì)胞上劃一條直線，用PBS清洗3次。培養(yǎng)48 h后觀察周邊細(xì)胞生長(zhǎng)程度并拍照，進(jìn)行比較分析。

1.2.6L1CAM蛋白表達(dá)檢測(cè) 檢測(cè)Ezrin基因沉默前后高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95D和低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞H460的L1CAM蛋白表達(dá)。同樣應(yīng)用小干擾RNA沉默95D和 H460細(xì)胞的Ezrin的表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)95D、siEzrin-95D、H460、siEzrin-H460細(xì)胞的L1CAM蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1Ezrin促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示在高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞系95D及PC9中Ezrin 表達(dá)均明顯高于低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞系H460及EBC-1(圖1)。應(yīng)用siRNA沉默95D細(xì)胞Ezrin基因表達(dá)，通過(guò)Western blot驗(yàn)證Ezrin基因沉默有效性(圖2A)后，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與95D細(xì)胞相比,siEzrin-95D細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(P<0.05)，見(jiàn)圖2B、C。

A:RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞系中Ezrin的表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞系中Ezrin的表達(dá)。

圖1細(xì)胞系中Ezrin的表達(dá)

A:Western blot檢測(cè)95D細(xì)胞及siEzrin-95D細(xì)胞中Ezrin的表達(dá)；B：劃痕試驗(yàn) 95D細(xì)胞及siEzrin-95D細(xì)胞經(jīng)處理48 h后細(xì)胞遷移情況；C：劃痕試驗(yàn)結(jié)果定量分析

圖2 Ezrin沉默對(duì)95D細(xì)胞遷移能力的影響

A．Western blot檢測(cè)Ezrin基因沉默前后95D細(xì)胞和H460細(xì)胞L1CAM的表達(dá)；B.L1CAM蛋白的定量分析

圖3 siRNA沉默95D細(xì)胞和H460細(xì)胞Ezrin

后細(xì)胞中L1CAM蛋白比較

2.2Ezrin 通過(guò)L1CAM信號(hào)通路調(diào)控肺癌細(xì)胞的遷移能力 前面試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，沉默95D細(xì)胞Ezrin表達(dá)后，其細(xì)胞遷移能力明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)siRNA沉默95D及H460細(xì)胞Ezrin表達(dá)后，與95D及H460細(xì)胞比較，siEzrin-95D及siEzrin-H460細(xì)胞中L1CAM的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，在有淋巴及遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者，且與肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[10]。Ezrin可以通過(guò)EGFR信號(hào)通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的演進(jìn)[11]。L1CAM在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[12-13]。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)Ezrin與L1CAM具有密切的相關(guān)性，提示Ezrin基因可能通過(guò)調(diào)控L1CAM的表達(dá)而促進(jìn)肺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但其具體調(diào)控機(jī)制目前鮮見(jiàn)報(bào)道，還有待于深入研究。KUDUMALA等[9]的研究證實(shí)Ezrin可以特異地與L1CAM結(jié)合，在黑腹果蠅的神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。AIKAWA[14]研究表明，L1CAM在靠近細(xì)胞膜表面的部位存在Ezrin泛素化結(jié)合域，并對(duì)其基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞等一系列生命活動(dòng)起到重要影響。KIEFEL等[15]在肺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Ezrin結(jié)合到L1CAM蛋白后可以介導(dǎo)并活化核因子kappa B(NF-κB)信號(hào)通路，從而促進(jìn)表皮間質(zhì)化(MET)的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，Ezrin在高轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞系。通過(guò)siRNA沉默抑制肺癌細(xì)胞Ezrin的表達(dá)后肺癌細(xì)胞遷移能力明顯下調(diào)，且Ezrin表達(dá)水平下調(diào)后L1CAM的表達(dá)顯著受到抑制。這提示，Ezrin的表達(dá)與肺癌細(xì)胞的遷移能力具有密切相關(guān)性，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控L1CAM信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。Ezrin及L1CAM分子有可能成為控制肺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)，該研究結(jié)果為臨床診治肺癌，尤其是預(yù)防肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移提供了重要的研究線索。

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