HMGB-1聯(lián)合MSCs移植對急性心肌梗死大鼠心臟功能影響的實驗研究*

唐一鋒，石 蓓，王冬梅，沈長銀

(1.貴州航天醫(yī)院心內(nèi)科，貴州遵義 563003，2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,貴州遵義 563099)

隨著生活水平的提高和經(jīng)濟的發(fā)展，心血管疾病已成為損害人類健康的重要慢性非傳染性疾病，給社會和家庭帶來沉重的負擔。既往研究報道，干細胞移植的能夠成為改善心肌梗死預(yù)后的新途徑，其中，骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植治療能夠有效地減少梗死區(qū)面積，促進交界區(qū)的微血管形成，有效提高心肌梗死后的心臟功能。本課題組在前期研究中同樣發(fā)現(xiàn)了MSCs移植的治療方法對于急性心肌梗死的預(yù)后存在有益作用[1-2]。高遷移率族蛋白1(HMGB-1)是細胞染色體結(jié)合蛋白家族的成員，具有引導樹突狀細胞和平滑肌細胞進行遷移的作用，同時也是血管原性和心臟性干/祖細胞的分化增強因子[3-5]。本研究通過建立雄性SD大鼠急性心肌梗死的生物學模型，分別對實驗大鼠注射HMGB-1及HMGB-1拮抗劑，同時聯(lián)合MSCs移植治療手段，進而觀察其梗死后的心肌組織附近局部新生血管的密度、心肌梗死的面積及心臟功能的變化情況，并測定大鼠血清血管生成因子和相關(guān)炎癥細胞因子水平的變化進而揭示其內(nèi)在相關(guān)的作用機制，從而探究外源性HMGB-1對梗死區(qū)域的心肌組織的局部微循環(huán)環(huán)境、移植的MSCs存活狀態(tài)及新生血管形成的作用。本研究旨在探究目前該領(lǐng)域存在的移植干細胞存活率較低，移植歸巢梗死區(qū)干細胞數(shù)量少等關(guān)鍵難題的解決方案。

1 材料與方法

1.1材料 干細胞培養(yǎng)選取的是體質(zhì)量為100～150 g的雄性3周齡SD大鼠；心肌梗死生物學模型建立則采用的是體質(zhì)量為200～250 g的2～3月齡的雄性SD大鼠。將144只SD大鼠分入健康對照組、模型對照組、MSCs移植組、HMGB-1注射組、HMGB-1注射+MSCs移植組、HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組等6個不同處理組，每組包含24只實驗大鼠。在術(shù)后第3、7、28天時對大鼠的心臟功能和血清炎癥相關(guān)細胞因子的水平進行檢測，取其組織標本進行病理學檢測分析。本實驗中采用的雄性SD大鼠全部來自陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，通過檢疫，全部符合國家實驗動物標準[證書號:SCXK(渝)2012-0005]。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs體外培養(yǎng)和鑒定 取100～150 g 3周齡的SD實驗大鼠，采用無菌分離的方法對雙側(cè)股骨、脛骨進行剝離提取，并通過貼壁離心的方法培育骨髓間充質(zhì)原代細胞，本研究中選取的是第3～4代干細胞進行操作。采用流式細胞儀對MSCs表面標記物進行檢測鑒定。

1.2.2大鼠心肌梗死模型的建立 10%濃度的水合氯醛溶液按照3 mL/kg體質(zhì)量水平用于腹腔的麻醉，同時進行心電圖的監(jiān)測，連通小動物呼吸機，給予正壓通氣，呼吸比為1∶3，潮氣量設(shè)為3 mL/100 g體質(zhì)量，呼吸頻率為100次/分鐘。于大鼠胸骨左緣的3～4肋間靠近下一肋骨的上緣打開胸腔，按照左心耳的根部和肺動脈的圓錐交叉點下方約2 mm的位置進行縫扎，并用5-0的縫合線對左冠狀動脈(后簡稱冠脈)前降支進行結(jié)扎，觀察到結(jié)扎冠脈供血區(qū)域心肌缺血蒼白且室壁局部運動減弱，監(jiān)測心電圖見J點明顯抬高則提示心肌梗死模型已成功建立。

1.2.3各組實驗動物處理方式 模型對照組：結(jié)扎前降支后心肌內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(PBS)150 μL；MSCs移植組：沿冠脈前降支走形心肌內(nèi)兩點注射1.0×106MSCs 150 μL；HMGB-1注射組：在結(jié)扎左前降支后，于前后腹膜內(nèi)各注射1次100 ng HMGB-1(10 μg/mL)；HMGB-1注射+MSCs移植組:在結(jié)扎左前降支后，于前后腹膜內(nèi)各注射1次100 ng HMGB-1(10 μg/mL)并沿冠脈前降支走形的心肌內(nèi)兩點注射1.0×106MSCs 150 μL；HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組:在結(jié)扎前降支后沿冠脈前降支后，于心肌內(nèi)兩點注射1.0×106MSCs 150 μL同時在腹膜內(nèi)注射HMGB-1 BoxA 400 μg。然后分別于第3、7和28天時處死各組實驗大鼠，從而保證每個時間點各個實驗組有6只大鼠。

1.2.4實驗動物取材 各組動物于各時間點予10%水合氯醛按3 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉。剪開胸腔并剝離心臟，采集下腔靜脈血約4～5 mL于采血管中，室溫下靜置1.5 h后，在4 ℃低溫離心機條件下進行離心，采用3 000 r/min離心速度，離心15 min，取出血清，放于-80 ℃冰箱進行保存。用10%濃度的氯化鉀溶液(3 mL/kg)通過下腔靜脈注射，使心臟停搏于舒張期，取出心臟，觀察各組心臟外觀并進行拍照。切取包含心肌的梗死區(qū)域的橫斷面。其中第28天的部分大鼠心臟置于濃度為4%的多聚甲醛溶液進行固定，24 h后進行石蠟包埋切片。

1.2.5心肌組織蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色 染色過程均按照南京建成生物工程研究所HE及Masson染色試劑盒說明書操作。

1.2.6超聲心動圖測定心功能 術(shù)后第28天，經(jīng)胸壁測量3個連續(xù)心動周期內(nèi)的左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)及短軸縮短率(LVFS)的結(jié)果。取3次結(jié)果均值納入分析。

1.2.72，3，5-氯化苯基四氮唑(TTC)染色測定心肌梗死面積 大鼠心肌梗死后的第28天，行TTC染色測定心肌梗死面積。通過下腔靜脈內(nèi)注射1.5 mL濃度為1%的TTC染液，5 min后注射濃度為10%的氯化鉀溶液造成心臟停搏。后取出心臟，用生理鹽水清洗，紗布吸干水分，并置于-80 ℃冰箱凍存10 min后，從心尖向心底部至心臟表面結(jié)扎點之間切取5～6個橫斷面，每片厚約1 mm。根據(jù)橫斷面觀察心肌染色情況，必要時將組織置于濃度為1%的TTC染液中，在室溫下重復染色5～8 min，用多聚甲醛固定15 min，紗布吸水后拍照。

1.2.8免疫組織化學檢測新生微血管 術(shù)后第28天時對各組大鼠進行處死處理，取材石蠟切片，免疫組織化學對CD31陽性的細胞和微血管進行計數(shù)。一抗：兔抗大鼠CD31(1∶50，1∶100，1∶200);二抗：生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)。本研究是根據(jù)Weidner微血管方法對上述組織細胞進行計數(shù)的。

1.2.9細胞因子水平變化檢測 通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測術(shù)后第3、7和28天時血清中Toll樣受體4(TLR4)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-6(IL-6)、HMGB-1，核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κb)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。

2 結(jié) 果

2.1MSCs的培養(yǎng)、鑒定和標記 將MSCs培育至第3～4代后，選出生長狀態(tài)較為良好的干細胞(共6.0×106)，CD45、CD29、CD90的陽性率分別為2.7%、99.1%和91.6%，該結(jié)果提示培養(yǎng)出的細胞為MSCs。選用第3代生長狀態(tài)較好的MSCs，予4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，觀察到MSCs細胞染色成功，細胞核藍色熒光表現(xiàn)。在計數(shù)時將高倍鏡調(diào)制為400倍，選取3個高倍視野進行計數(shù)，以鏡下平均數(shù)計算標記率為94%,見圖1。

A:培養(yǎng)第 4代MSCs(×100);B:熒光顯微鏡下顯示DAPI標記的細胞核為藍色(×100)

圖1 DAPI標記MSCs

2.2大鼠急性心肌梗死模型評估 大鼠健康心肌細胞排列整齊有序，形態(tài)健康(圖2A、B)。成功建模后28 d，取心臟組織作石蠟切片HE、Masson染色，見肌細胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)消失，核溶解，被大量纖維組織所替代，并瘢痕組織形成(圖2C、F)。病理改變證實心肌梗死建模成功。

A:大鼠健康心肌(HE染色，×200)；B：大鼠健康心肌(Masson染色，×200)；C：梗死心肌(HE染色，×100)；D：梗死心肌(Masson染色，×100)；E：梗死心肌(HE染色，×200)；F：梗死心肌(Masson染色，×200)

圖2健康大鼠心肌及大鼠心肌梗死模型HE及

Masson染色圖片

2.3心功能測定 心肌梗死術(shù)后第28天進行心臟彩超測定。結(jié)果顯示，與模型對照組相比，MSCs移植組、HMGB-1注射組、HMGB-1注射+MSCs移植組及HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組LVDD、LVDS水平明顯降低，LVFS、LVEF水平明顯升高(P<0.05)，其中，HMGB-1注射+MSCs移植組心功能改善最好，見表1。

表1 心肌梗死術(shù)后第28天各組心臟超聲檢測結(jié)果

a：P<0.05，與模型對照組比較；b：P<0.05，與HMGB-1注射+MSCs移植組比較

2.4心肌梗死面積測定及新生血管檢測 模型對照組梗死面積占左室面積(35.23±4.20)%；與模型對照組相比，MSCs移植組[(24.58±1.50)%]、HMGB-1注射組[(28.11±2.10)%]、HMGB-1注射+MSCs移植組[(21.23±1.80)%]、HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組[(27.74±1.30)%]梗死的面積占左室的面積均較小，其中HMGB-1注射+MSCs移植組的梗死面積與MSCs移植組、HMGB-1注射組、HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組梗死面積比較，明顯縮小(P<0.05)，見圖3。

A:正常對照組;B:模型對照組;C:MSCs移植組;D:HMGB1注射組;E:HMGB1注射+MSCs移植組;F:HMGB1 BoxA注射+MSCs移植組。

圖3心肌梗死模型建立后28 d心肌TTC染色圖

另外，與健康對照組微血管的數(shù)量(2.12±0.18)相比，模型對照組的梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)的新生微血管顯著增加(6.38±0.25)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MSCs移植組、HMGB-1注射組、HMGB-1注射+MSCs移植組、HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組的梗死區(qū)及梗死交界區(qū)的微血管數(shù)量分別為12.54±1.50、9.16±1.10、13.95±1.80、11.55±1.10。HMGB-1注射+MSCs移植組較其他組明顯增加(P<0.05)。

2.5血清各細胞因子水平變化情況 模型對照組、MSCs移植組的血清HMGB-1水平在術(shù)后均呈升高趨勢，MSCs移植組的血清HMGB-1水平明顯高于健康對照組，而低于模型對照組(P<0.05)，見表2。除健康對照組外其余各組的血清VEGF水平在術(shù)后均呈升高趨勢。HMGB-1注射+MSCs移植組VEGF水平最高(P<0.05)。除健康對照組外，其他各組大鼠的血清TLR4、IL-6、NF-κb、TNF-α水平在術(shù)后均呈現(xiàn)升高趨勢。HMGB-1注射+MSCs移植組與模型組與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第3天和第7天，除健康對照組其余各組的TLR4水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)。第3天HMGB-1注射組IL-6、NF-κb、TNF-α水平高于模型對照組，第7天MSCs移植組、HMGB-1注射組、HMGB-1注射+MSCs移植組、HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植組IL-6、NF-κb、TNF-α水平低于模型對照組(P<0.05)，見表3。

表2 不同時間點各組血清HMGB-1水平比較

a：P<0.05，與MSCs移植組比較

表3 不同時間點各血清細胞因子水平

續(xù)表3 不同時間點各血清細胞因子水平

a：P<0.05，與健康對照組比較；b：P<0.05，與HMGB-1注射+MSCs移植組比較

3 討 論

近年采用MSCs移植治療心肌梗死是新的研究靶點，既往研究表明，MSCs主要可以分化為心肌樣細胞[6-8]，并通過血管分化和細胞融合作用促進血管生長[3]。除此之外，MSCs還具有一定旁分泌作用，主要包括抗凋亡、促增殖分化、促血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗疤痕、化學趨化等作用[4,9]。因此，MSCs成為了心血管疾病治療領(lǐng)域的重要種子細胞之一，其應(yīng)用前景比較廣闊。

本研究結(jié)果表明，MSCs移植組與模型對照組相比，可以明顯改善心肌梗死后心臟的受損程度。MSCs移植組的抗炎因子的表達水平升高、促炎因子的表達水平降低，均說明MSCs在急性心肌梗死后梗死區(qū)及梗死交界區(qū)的恢復過程中發(fā)揮了減輕免疫炎性反應(yīng)、促進修復和改善心室重塑的保護作用。因此，提高移植細胞的生物學效應(yīng)對改善干細胞移植治療心肌梗死方法的臨床預(yù)后具有關(guān)鍵作用，后續(xù)研究應(yīng)在這一領(lǐng)域進行深入的探究。

在心肌梗死的病理生理過程中，HMGB-1可能是促進早期炎性反應(yīng)及參與后期組織修復的重要因素[10-13]。本課題組前期體外研究結(jié)果提示，MSCs的細胞質(zhì)和細胞核中分別存在TLR4和RAGE受體，HMGB-1可以促進MSCs分泌VEGF和IL-10，分泌量均與HMGB-1的劑量和時間明顯相關(guān)[14]。既往研究表明，HMGB-1與MSCs細胞內(nèi)HMGB-1受體的結(jié)合，可能是MSCs增殖及旁分泌作用得到促進的重要因素[15]。綜上，HMGB-1可能是通過作用于MSCs表面HMGB-1受體，進而協(xié)同MSCs發(fā)揮改善心功能、促進心室重塑的功能。

值得注意的是，在心肌梗死病理生理轉(zhuǎn)歸過程中，是HMGB-1產(chǎn)生的促炎癥級聯(lián)反應(yīng)[15-16]導致心肌組織的損傷加重，還是其作用于MSCs受體，促進免疫和炎癥細胞遷移及旁分泌而改善免疫炎性反應(yīng)從而幫助心肌修復，目前仍存在爭論，有待接下來的研究進一步揭示。AIKAWA等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1還可以通過加強c-kit+細胞的增殖與分化促進心肌梗死后的心室重塑。另外也有研究表明HMGB-1可以作用于人心臟成纖維細胞表面的RAGE受體促進生長因子如VEGF、IL-10等的表達，改善心肌細胞的修復[17-18]。因此，MSCs移植后在心功能改善中何種機制占主導作用，以及TLRs及RAGE信號通路如何調(diào)節(jié)MSCs趨化作用和旁分泌誘導作用等機制還需進一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，較單MSCs移植治療或單HMGB-1注射治療方法，HMGB-1聯(lián)合MSCs移植治療對大鼠急性心肌梗死后心功能改善、心肌梗死面積減少和局部新生血管生成等更為有益，其機制可能是通過促進生長因子如VEGF、TLR4等細胞因子水平，同時降低IL-6、TNF-α、NF-κb等促炎因子水平來介導的。

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