左卡尼汀對感染性休克患者血小板及線粒體的影響

李力 汪峰

九江學(xué)院附屬醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2普外科（332000九江）

膿毒癥導(dǎo)致對器官功能衰竭的發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為，感染所引起的全身炎癥反應(yīng)可抑制線粒體功能，導(dǎo)致組織器官?zèng)]有足夠的能量來維持正常的功能，機(jī)體處于低代謝狀態(tài)甚至器官衰竭。然而從人體臟器獲取線粒體很難實(shí)現(xiàn)。但是循環(huán)血液中的血小板線粒體含量豐富，甚至在危重患者中也容易獲得。并且血小板線粒體功能可以用不同技術(shù)方法進(jìn)行檢測。也可作為線粒體靶向治療藥物效果的評估。本研究通過監(jiān)測血小板水平以及血小板線粒體功能，來判斷左卡尼汀注射液對膿毒癥患者血小板的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年12月至2016年11月在我院ICU住院的膿毒癥患者62例，其中男35例、女27例，年齡27～76歲。將患者隨機(jī)分為兩組，各31例，兩組患者的性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均符合2014年《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》關(guān)于膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，ICU住院時(shí)間超過7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有慢性器官功能損害患者，如慢性腎衰竭、肝硬化、慢性呼吸衰竭等；（2）惡性腫瘤患者；（3）自身免疫系統(tǒng)疾病患者；（4）確診后7 d內(nèi)自動(dòng)出院或死亡患者；（5）存在明確藥物過敏的患者；（6）用藥劑量不足或療程不足7 d、檢測指標(biāo)不全、及治療期間輸注血小板；（7）近2周用過影響血小板的藥物，如阿司匹林、血寧片等等。

1.3 治療方法 采用前瞻性開放式完全隨機(jī)對照試驗(yàn)，將63例患者隨機(jī)分為治療組和對照組。對照組：參考《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》采取常規(guī)集束化治療方案。治療組：在常規(guī)集束化治療方案基礎(chǔ)上，加用左卡尼汀注射液（常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)）4 g加入生理鹽水100 mL靜脈滴注，每日1次，每次滴注時(shí)間約30 min，持續(xù)用藥7 d。

1.4 樣本處理 兩組患者分別于治療前及治療第3、7 d留取新鮮靜脈血樣5 mL，干燥采血管中加入50 U/mL肝素抗凝處理。用生理鹽水等倍稀釋后，經(jīng)Percoll（1.06 g/mL）密度梯度離心法（20℃，2 000 r/min，7 min）取F2白色絮狀層，PBS冷凍洗滌3遍以上即得到分離純化的血小板備用。

1.5 檢測指標(biāo) 血小板數(shù)量的檢測：所有患者分別于入院時(shí)、入院后3、7 d抽取新鮮靜脈血樣送檢驗(yàn)科檢測血小板數(shù)值。血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的檢測：在細(xì)胞正常狀態(tài)時(shí)，Calcein可進(jìn)入線粒體內(nèi)發(fā)出綠色強(qiáng)熒光，僅在細(xì)胞線粒體膜受損后，通透性轉(zhuǎn)變孔開放的情況下，CoCl2可進(jìn)入線粒體內(nèi)淬滅該熒光。因此，該技術(shù)可用于判斷細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放程度，間接判斷線粒體是否損傷。以Calcein?AM與CoCl2共同孵育血小板15 min，冷凍PBS洗滌后，采用流式細(xì)胞儀（BD FACS CotoⅡTM）進(jìn)行定量檢測，以細(xì)胞平均綠色熒光強(qiáng)度衡量線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的狀態(tài)。血小板線粒體跨膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）檢測：采用JC?1染色方法鑒定細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位ΔΨm的變化。以JC?1孵育血小板15 min后，PBS冷凍洗滌，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測，以綠色熒光（低ΔΨm細(xì)胞）所占百分比衡量血小板線粒體去極化的百分?jǐn)?shù)。血小板線粒體內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量檢測：以熒光素-熒光素酶法檢測血小板線粒體ATP水平，血小板懸液（2×106/mL）與檢測試劑等比混合，室溫孵育15 min，采用Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度（RLU）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分析比較兩組數(shù)據(jù)間方差齊性，方差齊則組間比較采用等方差樣本SNK檢驗(yàn)，方差不齊則組間比較采用異方差樣本Dunnetts′C檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板數(shù)量的比較 兩組患者在入院時(shí)血小板數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，入院后3 d治療組患者血小板數(shù)值仍低于入院時(shí)數(shù)值，而入院后7 d患者血小板數(shù)值高于入院時(shí)數(shù)值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者血小板數(shù)值均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血小板數(shù)量比較Tab.1 Comparison of platelet count ±s

表1 血小板數(shù)量比較Tab.1 Comparison of platelet count ±s

注：與同組入院時(shí)比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時(shí)78.42±2.34 78.34±3.40入院3 d 51.32±2.45 62.33±2.43*#入院7 d 64.52±5.36 91.41±4.23*#

2.2 兩組血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的變化 兩組患者在入院時(shí)Calcein值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，入院后7 d患者Calcein值高于入院時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者Calcein值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔變化比較Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

表2 血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔變化比較Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

注：與同組入院時(shí)比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時(shí)197.32±56.19 196.63±53.74入院3 d 165.53±42.13 185.12±51.82#入院7 d 187.34±35.41 234.24±40.67*#

2.3 兩組血小板線粒體膜電位的變化 兩組治療前低線粒體膜電位細(xì)胞含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，入院后3 d及入院后7 d治療組患者低線粒體膜電位細(xì)胞含量較治療前降低（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者低線粒體膜電位細(xì)胞含量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 血小板線粒體膜電位下降分布率比較Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

表3 血小板線粒體膜電位下降分布率比較Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

注：與同組入院時(shí)比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時(shí)34.42±3.27 34.33±4.51入院3 d 37.01±5.13 32.33±2.12*#入院7 d 32.23±3.27 23.85±4.43*#

2.4 兩組血小板線粒體內(nèi)ATP水平的變化 兩組治療前血小板內(nèi)ATP相對含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，入院后3 d及入院后7 d治療組患者血小板內(nèi)ATP水平均較治療前均增高（P＜0.05），入院后3、7 d治療組患者Calcein值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失控導(dǎo)致危及生命的器官功能衰竭［1］。其主要特征是線粒體功能障礙，而線粒體功能降低在MODS的發(fā)生、發(fā)展及功能恢復(fù)中起關(guān)鍵性作用［2-3］。在膿毒癥早期即出現(xiàn)線粒體對氧利用障礙［4］。隨著膿毒癥病情的進(jìn)展，線粒體功能及數(shù)量均下降，為了適應(yīng)線粒體能量供應(yīng)，組織器官通過降低或關(guān)閉細(xì)胞功能來減少能量需求，從而形成一個(gè)新的供需平衡即器官功能障礙（MODS）［5］。如果嚴(yán)重膿毒癥持續(xù)時(shí)間過長，線粒體結(jié)構(gòu)和功能將呈現(xiàn)不可逆性的改變，最終導(dǎo)致線粒體功能衰竭，細(xì)胞能量枯竭，引起器官功能衰竭而死亡。

左卡尼汀即左旋肉堿是哺乳動(dòng)物能量代謝中必需的體內(nèi)天然物質(zhì)。對線粒體功能的改善有重要作用：（1）左卡尼汀通過乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的活動(dòng)，參與在脂酰肉堿和脂酰?CoA酯之間平衡的建立這對維持線粒體功能至關(guān)重要［6］；（2）左卡尼汀通過維持能量代謝相關(guān)酶以及氧化磷酸化的線粒體關(guān)鍵酶的活性穩(wěn)定線粒體膜［7-8］，并改善受損線粒體超微結(jié)構(gòu)、維持線粒體長度、減少線粒體損傷的數(shù)量，從而阻止細(xì)胞凋亡［9］；（3）左卡尼汀對于線粒體功能損傷的保護(hù)也有抗氧化和抗炎的機(jī)制參與［10-12］。在代謝應(yīng)激時(shí)，線粒體積累脂酰?COA，是為了保持機(jī)體卡尼汀穩(wěn)態(tài)。足夠量的游離卡尼汀可促使堆積的脂酰?CoA進(jìn)入線粒體內(nèi)，使氧化磷酸化得以順利進(jìn)行。還能增加NADH細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素氧化酶的活性、加速ATP的產(chǎn)生，從而提高組織細(xì)胞能量供應(yīng)，阻止器官功能衰竭。

通過對在醫(yī)院ICU 62例膿毒血癥患者研究顯示，加用左卡尼汀治療的患者和常規(guī)治療患者在入院時(shí)血小板數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而入院后7 d，加用左卡尼汀治療的患者血小板數(shù)量不僅較治療前高，還高于常規(guī)治療患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且左卡尼汀組患者Calcein值同樣高于常規(guī)治療患者和治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而左卡尼汀治療的患者入院后3、7 d低線粒體膜電位細(xì)胞含量均較治療前降低（P＜0.05），且下降程度均高于對照組（P＜0.05）；左卡尼汀治療的患者血小板內(nèi)ATP含量同樣是入院后3、7 d均較治療前明顯升高（P＜0.05），且均高于對照組（P＜0.05）。說明左卡尼汀可明顯改善線粒體膜通透性及膜電位，使線粒體功能恢復(fù)，從而增加血小板能量供應(yīng)，阻止血小板凋亡。

綜上所述，應(yīng)用左卡尼汀注射液4 g靜脈滴注能夠有效改善膿毒癥休克患者血小板線粒體結(jié)構(gòu)和功能，并阻止血小板凋亡。

表4 血小板細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化Tab.4 Changes of ATP content in platelet

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