間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)IL?10對心肌梗死模型大鼠心功能的影響

王成 李霞 劉振 韓明磊 侯永蘭 齊曉勇

1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)一科（河南新鄉(xiāng) 453000）；2河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科（石家莊 050051）

近年來，心肌梗死（myocardial infarction，MI）發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步升高，其治愈率低，死亡率高，已成為威脅人類生命的頭號殺手［1-2］。目前，臨床研究發(fā)現(xiàn)，心肌中存在少量干細(xì)胞，可減緩MI的惡化及進(jìn)展同時(shí)促進(jìn)受損區(qū)恢復(fù)，但由于干細(xì)胞量較少，且心肌細(xì)胞缺乏增殖分化能力，造成受損區(qū)域不能得到完全修復(fù)，最終由成纖維細(xì)胞填充而形成瘢痕組織［3-5］。由此導(dǎo)致的心室重構(gòu)是MI患者發(fā)生頑固性心力衰竭和死亡的主要原因。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，將間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）移植到MI部位，可減小梗死面積、抑制心肌纖維化、改善心臟功能［6］。作為近來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，MSC的功能仍在不斷挖掘中?，F(xiàn)今，較為認(rèn)可的方面即是MSC與MI存在某種關(guān)聯(lián)［7］。國外學(xué)者GLEESON等［8］人以骨髓來源的MSC為例，對造血干細(xì)胞的再生潛能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對促進(jìn)大鼠MI區(qū)膠原合成有一定作用，但作用機(jī)制并不明確。國內(nèi)學(xué)者耿志敏等［9］亦發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以促進(jìn)大鼠 MI后的血管新生，進(jìn)一步改善心功能；在其實(shí)驗(yàn)過程中，腫瘤壞死因子?α（TNF?α），白細(xì)胞介素?10（IL?10）和白細(xì)胞介素?6（IL?6）均發(fā)生了明顯變化，然而作者未探究此現(xiàn)象與MSC及MI三者的關(guān)聯(lián)，后續(xù)研究仍有必要。筆者查閱資料發(fā)現(xiàn)，除了損傷移植后MSC的細(xì)胞活性外，上述炎性細(xì)胞因子可能是前體細(xì)胞損傷后更新活性以及觸發(fā)病理生理改變的關(guān)鍵點(diǎn)之一［10］。其中，IL?10是一種強(qiáng)效的抗炎細(xì)胞因子，其治療心功能障礙的潛力和炎癥過程已有文獻(xiàn)支持，雖具體作用機(jī)制及上下游調(diào)控因子尚未得到證實(shí)，但此研究方向值得深入探討。因此，本研究通過對大鼠建立MI模型，真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IL?10，使其過度表達(dá)，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的心功能指標(biāo)、炎癥因子和凋亡細(xì)胞變化，進(jìn)一步研究MSC移植基礎(chǔ)上IL?10治療MI的作用效果及機(jī)理。

表1 RT?PCR引物序列表Tab.1 Prime sequence of real time fluorescent quantitative PCR

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級健康雄性SD大鼠若干只，體重均處于（110±20）g，鼠齡4周齡，由上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。于20℃恒溫下飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 低糖DMEM（hyclone），兔抗鼠Caspase?3 一抗、IL?10一抗、TNF?α一抗、IL?1β一抗及GAPDH抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司），真核表達(dá)載體pcDNA3?IL?10 及轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體 Lipofectamine2000，Masson染色試劑盒（賽默飛有限公司），免疫熒光試劑盒BPIF30?1KT（美國Protein Biotechnologies公司），內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRI及T4連接酶（Promega公司）。MYLAB30.CV彩色多普勒超聲診斷儀，Western blot成像系統(tǒng)（創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司），fermentas RT?PCR試劑盒及其相應(yīng)產(chǎn)品，電泳儀（上海伊瑞生物科技儀器有限公司）。

1.3 獲取IL?10基因組 取大鼠外周血5 mL，分離出單個核細(xì)胞，PBS沖洗后于37℃、5%CO2下孵育24 h。根據(jù)RNA試劑盒說明書提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增IL?10。擴(kuò)增的IL?10具有啟動編碼序列，未有內(nèi)終止信號，產(chǎn)物全長660 bp。IL?10上游5′端引入酶切位點(diǎn)HindⅢ，下游5′端構(gòu)建EcoRI的酶切序列，同時(shí)引入Kozak序列。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，獲取目的基因片段。

1.4 構(gòu)建表達(dá)載體 根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)的HindⅢ、EcoRI將上述片段酶切，獲得全長IL?10 cDNA；應(yīng)用HindⅢ、EcoRI雙酶切pcDNA3；低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段，加入TE緩沖液溶解后，運(yùn)用T4 DNA連接酶連接pcDNA3與IL?10cDNA片段，將鼠IL?10 cDNA定向克隆至表達(dá)載體pcDNA3質(zhì)粒中；取適量轉(zhuǎn)染產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，同時(shí)，接種于氨芐青霉素陽性瓊脂平板。室溫孵育24 h后，接種針隨機(jī)挑選部分菌落培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并采用酶切鑒定pcDNA3 IL?10表達(dá)載體。

1.5 MSC的提取、培養(yǎng)及載體轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)在經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。取SD大鼠，脫頸處死后，無菌條件下分離股骨和脛骨；暴露兩端骨髓腔后，用吸有低糖DMEM的注射器（5 mL）沖洗骨髓腔，繼而反復(fù)吹打，形成懸液且骨髓腔呈現(xiàn)白色后收集洗出液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，梯度離心后重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中后置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3天換一次培養(yǎng)液，10 d后傳代。取傳至第3代的MSC，消化、離心、重懸。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，24 h后接種6孔板，確保細(xì)胞能鋪滿孔底50%左右；參照脂質(zhì)體Lipo2000說明書，將pcDNA3?IL?10、pcDNA3分別導(dǎo)入 MSC 細(xì)胞，以G418（800 μg/mL）進(jìn)行篩選。于轉(zhuǎn)染結(jié)束后24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用RT?PCR方法檢測IL?10的mRNA的相對表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.6 大鼠MI模型的建立 SD大鼠120只，建立MI模型：對所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行肌肉注射麻醉，固定，乙醇醇消毒，切開氣管插入導(dǎo)管，控制呼吸機(jī)的壓力和頻率。沿左側(cè)第4肋間鈍性分離，充分暴露胸部后，將心包膜刺穿剝開，采用6-0縫線結(jié)扎左冠狀動脈前降支；隨機(jī)分為3組，即實(shí)驗(yàn)對照組：結(jié)扎冠狀動脈后心肌注射MSC與PBS混合懸液（C組）；pcDNA3?IL?10轉(zhuǎn)染組：結(jié)扎冠狀動脈后心肌注射轉(zhuǎn)染pcDNA3?IL?10的MSC懸液（P組）；pcDNA3空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：結(jié)扎冠狀動脈后心肌注射轉(zhuǎn)染pcDNA3的MSC懸液（K組）。MI模型建立后，可見左心室前壁顏色變白，此時(shí)，將PBS（混合的細(xì)胞懸液）分5點(diǎn)從心外膜注射到梗死區(qū)域（半徑0.5 cm內(nèi)），每點(diǎn)0.1 mL，清理干凈后逐層縫合，置于恒溫恒濕的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 術(shù)后檢測指標(biāo) 造模后1、2、4周時(shí)各組取6只大鼠進(jìn)行心臟超聲檢測：大鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后仰臥固定，取右側(cè)臥位，采用GEVIVID7超聲儀（10 MHz探頭頻率）放置胸骨左緣第4、5肋間，分別記錄不同時(shí)間點(diǎn)下各組的心超指標(biāo)；同時(shí)，計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與短軸縮短率（FS），其公式為：左心室射血分?jǐn)?shù)=（左心室舒張末橫截面積-左心室收縮末橫截面積）/左心室舒張末橫截面積×100；左室短軸縮短率%=（左心室舒張末內(nèi)徑-左心室收縮末內(nèi)徑）/左心室舒張末內(nèi)徑×100。術(shù)后4周時(shí)，再次麻醉大鼠，穿刺動脈插入直徑為1 mm的聚乙烯導(dǎo)管直至左心室，連接生理記錄儀，測量心率（HR）、左心室收縮末壓力（LVSP）、左心室舒張末壓力（LVEDP），然后計(jì)算左心室壓最大升降速度（±dp/dtmax）。

1.9 檢測各組大鼠梗死區(qū)域面積 術(shù)后4周檢測完左心室功能后，處死大鼠，迅速摘取心臟，用生理鹽水沖洗后，沿左室長軸將心臟切成1 mm厚的切片，4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、低溫保存、冰凍切片（4 μm）。先用DAB染色，反應(yīng)5 min；后用蘇木素復(fù)染，冰醋酸洗凈封片后觀察。在400倍下每張切片隨機(jī)選取5個視野，SigmaScan圖像處理系統(tǒng)測量左室最短徑與最長徑、內(nèi)外周長、弧長，計(jì)算梗死面積。

1.10 組織免疫熒光檢測Caspase?3 取丙酮處理過的冰凍切片，室溫復(fù)溫后加入0.1%Triton X?100，浸泡15 min后，1%BSA液封閉1 h，滴入稀釋后的Caspase?3一抗，4℃孵育過夜。次日，棄一抗，用0.01%PBS洗凈，加入熒光標(biāo)記的二抗，于室溫下避光孵育30 min，棄二抗，PBS洗3次，加入DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。PBS沖洗后，防熒光淬滅劑封片，采用熒光顯微鏡×200倍下觀察，拍照并計(jì)算熒光強(qiáng)度

1.11 Western blot檢測相關(guān)炎性因子 取梗死區(qū)和非梗死區(qū)冰凍切片標(biāo)本，勻漿，加入裂解液提取總蛋白，BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。SDS?PAGE（15%分離膠，5%濃縮膠）凝膠電泳分離后，4℃100 V恒壓電泳，蛋白上樣后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入適當(dāng)稀釋TNF?α一抗、IL?1β一抗4℃過夜，加TBS洗膜后加入HRP標(biāo)記的IgG二抗，常溫孵育1 h。DAB試劑盒顯色，分別用TNF?α和IL?1β與GAPDH條帶的吸光面積積分比值來評定各檢測因子的表達(dá)水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)均以SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)表示方法為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。重復(fù)測量方差分析不同時(shí)間點(diǎn)下各組大鼠射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率的差異，同時(shí)，采用方差分析探索各組建模后4周的心臟血流動力學(xué)指標(biāo)變化，兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)，以探索過表達(dá)IL?10對心功能的作用。Caspase?3免疫熒光檢測結(jié)果及TNF?α、IL?1β蛋白印記結(jié)果亦采用方差分析、SNK?q檢驗(yàn)分析各組結(jié)果差異，探索IL?10的可能作用機(jī)制，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組IL?10 mRNA表達(dá)含量 RT?PCR檢測轉(zhuǎn)染后，各組IL?10 mRNA表達(dá)含量，其結(jié)果顯示：與C組相比，P組IL?10 mRNA含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而K組表達(dá)水平近似C組，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組IL?10 mRNA表達(dá)含量Fig.1 The expression of IL?10 mRNA in each group after transfection

2.2 大鼠術(shù)后心超檢測結(jié)果 由表2可見，術(shù)后第7、14及28天，C組、K組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)呈先上升后下降的趨勢，上升及下降趨勢并不明顯，而P組則一直呈上升趨勢。比較各時(shí)間點(diǎn)下，每組射血分?jǐn)?shù)的差異，可知，各組在不同時(shí)間點(diǎn)下，三組射血分?jǐn)?shù)隨時(shí)間變化并無明顯差異（P＞0.05）；C、K兩組各點(diǎn)數(shù)值相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P組各時(shí)間點(diǎn)下射血分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)大于前兩組（P＜0.05）；組間對比，P組顯著高于K 組（FC?P=4.382，PC?P=0.043）、C組（FK?P=8.168，PK?P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；處理措施的不同與檢測時(shí)間存在交互作用，差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F交互=2.564，P交互=0.015）。分析各組左室短軸縮短率隨時(shí)間變化的差異，由表3可知，建模后，各組大鼠左室短軸縮短率并無明顯變化趨勢，不同時(shí)間點(diǎn)下各組數(shù)值波動較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；從各時(shí)間點(diǎn)3組左室短軸縮短率及整體組間比較來看，P組均顯著高于C 組（FC?P=5.187，PC?P=0.000），K 組（FK?P=5.084，PK?P=0.000）。各時(shí)間點(diǎn)下各組檢測指標(biāo)存在交互作用（F交互=2.233，P交互=0.022）。

2.3 三組大鼠心臟血流動力學(xué)檢測結(jié)果 檢測過表達(dá)IL?10后對大鼠心臟血液動力學(xué)的影響，結(jié)果顯示：P組的LVSP顯著高于C組、K組，而LVEDP則明顯低于前兩組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。三組左室內(nèi)壓變化速率相比，P組+dp/dt?max、?dp/dtmax較于C、K兩組明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見圖4。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)下左心室射血分?jǐn)?shù)Tab.2 The left ventricular ejection fraction in each group at different time %，±s

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)下左心室射血分?jǐn)?shù)Tab.2 The left ventricular ejection fraction in each group at different time %，±s

注：FC?P=4.382，PC?P=0.043；FK?P=8.168，PK?P=0.000；F 交互 =2.564，P交互=0.015；與C組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與K組比較：ΔP ＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別C組K組P組術(shù)后7 d 36.14±5.06 34.73±4.90 40.25 ± 4.33*Δ術(shù)后14 d 37.22±4.56 35.42±3.59 46.67 ± 3.88*Δ術(shù)后28 d 35.56±4.81 33.01±5.15 47.51 ± 3.62**ΔΔ

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)下左室短軸縮短率Tab.3 The shortening rate of left ventricular short axis in each group at different time %，±s

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)下左室短軸縮短率Tab.3 The shortening rate of left ventricular short axis in each group at different time %，±s

注：FC?P=5.187，PC?P=0.000；FK?P=5.084，PK?P=0.000；F 交互 =2.233，P交互=0.022；與C組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與K組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別C組K組P組術(shù)后7 d 35.33±4.32 35.93±4.17 46.46 ± 5.65*Δ術(shù)后14 d 36.76±3.48 37.89±4.33 50.22 ± 4.70**ΔΔ術(shù)后28 d 38.27±4.01 35.54±4.65 48.34±4.26*Δ

表4 各組大鼠MI面積差異Tab.4 The difference of MI area in each group ±s

表4 各組大鼠MI面積差異Tab.4 The difference of MI area in each group ±s

注：與C組比較，*P＜0.05；與K組比較：ΔP＜0.05

組別P組K組C組梗死面積（%）36.80±3.22*Δ 39.57±2.36 40.32±2.14 F值P值2.4180.017

圖4 大鼠心臟血流動力學(xué)檢測結(jié)果Fig.4 The results of cardiac hemodynamics in rats

2.4 各組大鼠MI區(qū)域面積比較 三組梗死面積不完全相同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.418，P=0.017），兩兩比較可知，C、K兩組大鼠梗死面積明顯高于P組（P＜0.05）；其兩組對比，無差異（P＞0.05）。

2.5 免疫熒光檢測結(jié)果 免疫熒光結(jié)果可知：C、K兩組中Caspase?3含量較高，熒光強(qiáng)度明顯，而P組僅表達(dá)少量Caspase?3，熒光強(qiáng)度并不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 各組TNF?α、IL?1β含量檢測結(jié)果 由Western blot結(jié)果可知，術(shù)后28 d時(shí)K、C兩組中MI區(qū)瘢痕組織中有大量TNF?α、IL?1β，表達(dá)水平明顯高于P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，K、C兩組相比，蛋白表達(dá)含量相差無幾（P＞0.05），見圖6。

圖5 各組Caspase?3免疫熒光結(jié)果（×200）Fig.5 The immunofluorescence results of Caspase?3 in each group

圖6 各組大鼠TNF?α、IL?1β含量檢測結(jié)果Fig.6 The detection results of TNF?and IL?1 in each group

3 討論

MI發(fā)生后，梗死部位心肌細(xì)胞發(fā)生壞死，隨即細(xì)胞外纖維基質(zhì)被破壞，導(dǎo)致梗死部位心室壁變薄、室壁應(yīng)力增高，并可能進(jìn)一步導(dǎo)致梗死區(qū)膨脹擴(kuò)展，嚴(yán)重者可能形成室壁瘤，甚至發(fā)生心臟破裂［11-12］。梗死部位的修復(fù)是心室重構(gòu)發(fā)生的主要因素，近年來，大量研究提示，MSC具有較高的可塑性，可促進(jìn)心肌再生［13］。學(xué)者楊躍進(jìn)等［14］人在研究中提示MSC可移植到心肌損傷部位，參與修復(fù)增強(qiáng)血管再生能力，改善局部微環(huán)境，修復(fù)壞死的心肌組織。雖有MSC損傷修復(fù)，但由于心臟原有干細(xì)胞較少，修復(fù)程度遠(yuǎn)不及損傷程度，加之MI底層發(fā)病機(jī)制仍不清楚，MSC修復(fù)尚不能達(dá)到預(yù)期效果。這提示對MSC的研究需要進(jìn)一步深入，以尋找發(fā)揮其價(jià)值的靶點(diǎn)。在最新的研究中，學(xué)者JUNG等［15］人發(fā)現(xiàn)IL?10可通過刺激巨噬細(xì)胞極化及成纖維細(xì)胞活化改善MI。亦有學(xué)者提出MI實(shí)質(zhì)上抑制了抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎作用受到阻礙［16］。目前，MSC、炎癥環(huán)境與心肌重塑三者的關(guān)系在國內(nèi)屬于較新研究點(diǎn)，發(fā)掘空間較大，可行性較高。因此，本研究通過移植過表達(dá)IL?10的MSC到大鼠MI部位周圍，觀察其對心臟梗死大鼠心臟功能及相關(guān)炎癥因子的影響。

IL?10是一種多細(xì)胞源的細(xì)胞因子，在促進(jìn)細(xì)胞生長與分化中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)。有研究顯示，MI的急性反應(yīng)期和亞急性反應(yīng)期，細(xì)胞內(nèi)IL?10基因表達(dá)產(chǎn)物明顯上升。中性粒細(xì)胞富集向梗死區(qū)移動，聯(lián)同巨噬細(xì)胞清除壞死細(xì)胞［17-18］。這提示，IL?10可能對MI大鼠具有保護(hù)作用。在本研究中，以MSC為工具，轉(zhuǎn)染pcDNA3?IL10到大鼠中，使之過表達(dá)，RT?PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。于術(shù)后1、2、4周分別檢測各組大鼠射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率，從結(jié)果可知，P組射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率均高于C、K兩組，與正常值相近。這提示在基于MSC移植上過表達(dá)IL?10可改善射血功能、左室收縮功能，進(jìn)一步提高心肌供血能力。為進(jìn)一步探究大鼠心功能指標(biāo)的變化，本研究在大鼠建模后第4周，檢測了各組大鼠的心臟血液動力學(xué)指標(biāo)，包括LVSP、LVEDP和±dp/dtmax。結(jié)果顯示，P組大鼠術(shù)后28 d后心臟LVSP和±dp/dtmax的數(shù)值均高于C組、K組，而LVEDP顯著低于兩組，這提示P組大鼠的心臟功能的恢復(fù)水平優(yōu)于C、K組，這可能是因?yàn)镮L?10的過表達(dá)促進(jìn)了MSC的抗炎過程，抗炎作用的增強(qiáng)可抑制其他炎性因子的作用，減輕梗死后急性炎癥期反應(yīng)，利于心臟自身分泌促血管生成因素，重建壞死心肌血運(yùn)。

細(xì)胞凋亡是梗死心肌區(qū)域細(xì)胞死亡、數(shù)量減少的機(jī)制之一，主要表現(xiàn)為凋亡信號通路的啟動和相關(guān)基因的表達(dá)，而Caspase?3是細(xì)胞凋亡基因中較為重要的一項(xiàng)，其控制凋亡的作用已等到公認(rèn)［19］。在本研究中，采用免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染IL?10后MI大鼠細(xì)胞中Caspase?3的表達(dá)含量。從結(jié)果可知，P組Caspase?3蛋白表達(dá)含量遠(yuǎn)低于C組、K組。這提示IL?10的過表達(dá)可抑制Caspase?3基因的表達(dá)，減緩心肌細(xì)胞凋亡的程度，此現(xiàn)象與學(xué)者趙洋等［20］人的研究結(jié)論一致。

與其他心臟病一樣，MI主要病因與心臟中炎性介質(zhì)的激活緊密相關(guān)。吳志林等［21］人的研究表明大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型中炎性反應(yīng)明顯增強(qiáng)。近年來大量研究顯示，炎癥因子在調(diào)控心肌結(jié)構(gòu)和功能中起著不可或缺的作用。TNF?α、IL?1β作為促炎因子中典型的兩類，在梗死后各個階段均呈顯著增長趨勢，使組織壞死、器官功能障礙的發(fā)生幾率明顯增加。在本研究western blot結(jié)果提示，P組TNF?α、IL?1β蛋白含量顯著低于C、K組，而C、K組無明顯差別，提示IL?10抗炎因子表達(dá)水平的增加，可使TNF?α、IL?1β表達(dá)含量減少，利于心肌細(xì)胞的恢復(fù)及心室重構(gòu)。這可能是MSC轉(zhuǎn)運(yùn)IL?10提高M(jìn)I大鼠心功能的作用機(jī)制，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由此，筆者將在日后的工作中，深入探究IL?10抗炎因子調(diào)控的信號通路及上下游因子的具體作用，以驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。綜上所述，MSC轉(zhuǎn)導(dǎo)IL?10可促進(jìn)MI發(fā)生后心功能的恢復(fù)，這可能與IL?10過表達(dá)抑制Caspase?3凋亡基因及TNF?α、IL?1β炎性因子的表達(dá)相關(guān)。

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