條件性胰島β細胞DEPTOR 基因敲除小鼠構(gòu)建及鑒定

賴舒暢 邱鴻 王肖 潘道延 王楨鈺 李凱 白曉春 沈潔

1南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（廣州 510515）；2南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗研究中心（廣州 510515）；3廣州中醫(yī)藥大學經(jīng)濟與管理學院（廣州 510515）

糖尿病的病因十分復(fù)雜，遺傳、環(huán)境、行為等多種因素共同參與、相互作用而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。全球的糖尿病患者超過4.15億，預(yù)計到2040年前，全球?qū)⒂?.42億糖尿病患者，這將給個人及社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔［1］。

哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守的絲氨酸-蘇氨酸類激酶，通過在體內(nèi)形成兩種不同的復(fù)合體對機體生長、代謝產(chǎn)生調(diào)控作用。mTOR與肥胖、糖尿病等代謝性疾病關(guān)系密切，在胰島素信號通路，胰島β細胞生長、發(fā)育、增殖以及調(diào)控代謝調(diào)節(jié)激素的合成分泌等多種途徑中發(fā)揮重要作用［2-3］。DEPTOR 是 2009 年，PETERSON 等［4］發(fā)現(xiàn)一類新的mTOR結(jié)合蛋白，能夠負性調(diào)節(jié)mTORC1和mTORC2的活性。盡管許多體外實驗已經(jīng)證實DEPTOR負性調(diào)控mTOR的作用，DEPTOR在體內(nèi)的作用仍然很少被了解。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DEP?TOR對細胞代謝也有著重要的影響。然而，目前對DEPTOR在代謝中作用的研究多數(shù)集中在細胞和分子水平，為進一步了解DEPTOR的作用，本課題組根據(jù)國際上常用的Cre/loxp系統(tǒng)原理，利用DEPTORloxp/loxp小鼠和胰島β細胞特異性表達Cre重組酶小鼠Ins1?Cre/ERT小鼠，成功構(gòu)建并鑒定了可誘導(dǎo)性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為在整體動物水平研究DEPTOR基因在胰島β細胞中的作用及糖尿病的發(fā)病機制提供了研究平臺。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠尾基因組DNA裂解液（A/B液）南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院中心實驗室配制：A液（0.5%SDS、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris.C1 pH8.0、100 μg/mL蛋白酶K），B液（NAOH 1 mmol/mL）；DNA Marker（Gen Star，Lot#6BB02）、瓊脂糖（BIOFROXX）購自廣州斯佳生物有限公司；EB替代物（GR501?01）、PCRmix（P212?02）南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR、QPCR引物均為上海生物工程有限公司合成；DEPTOR一抗、熒光二抗（Abcam）購自廣州新晉生物有限公司；Insulin一抗（santa cruz），DAPI（invitrogen）購自廣州杰特偉生物科技有限公司；其他常用試劑：EDTA、Tris堿、鹽酸、氫氧化鈉、等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

1.2.1 條件性胰島β細胞特異表達Cre重組酶小鼠 B6.Cg?Tg（Ins1?cre/ERT）1Lphi/J小鼠（JAX#024709，以下簡稱Cre小鼠）由上海茂生生物有限公司代理從美國JACKSON實驗室引進。

1.2.2 DEPTORloxp/loxp小鼠DEPTORtm1a（EUCOMM）

Wtsi克隆胚胎干細胞EPD0556_1_H09購自歐洲突變小鼠資源庫（EUCOMM ID：41725，德國），種系傳播嵌合小鼠由上海南方模式生物中心構(gòu)建。野生型（C57BL/6）小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2.3 兩種基因小鼠的飼養(yǎng)和繁殖 將小鼠置于潔凈的層流動物房內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照，晝夜交替。DEPTORloxp/loxp采用雌雄均為DEPTORloxp/loxp的純合子進行交配繁殖，Cre小鼠采用Cre重組酶雜合子（Cre+/-）和野生型小鼠進行交配繁殖。動物實驗經(jīng)過南方醫(yī)科大學倫理委員會審核。

1.2.4 條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠的構(gòu)建流程 基于Cre/loxp系統(tǒng)原理，構(gòu)建流程如下：DEPTORloxp/loxp小鼠與Cre+/-小鼠交配，得到F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠。獲得的F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠再與DEPTORloxp/loxp小鼠交配，得到DEP?TORloxp/lox.Cre+/-小鼠。DEPTORloxp/lox.Cre+/-基因型小鼠即為本實驗所要構(gòu)建模型小鼠的基因型。在小鼠胰島β細胞中，胰島素與外源性他莫昔芬同時作用下可誘導(dǎo)Cre重組酶表達，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列。因此通過控制外源性注射他莫昔芬時間可獲得不同周齡胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠。

1.3 小鼠基因型鑒定

1.3.1 小鼠組織DNA提取 于3～4周齡時候剪取小鼠鼠尾約2 mm，并置于1.5 mL EP管中。加入100 μL鼠尾裂解液A液，100℃金屬浴加熱1 h；4 000轉(zhuǎn)離心5 min，吸取上清移入新的EP管中；加入鼠尾裂解液B液100 μL，振蕩混勻，制得DNA模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳和成像分析 利用DEPTOR基因和Cre基因的鼠特異性引物（表1A）進行PCR反應(yīng)。DEPTOR基因PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，引物各 2 μL（引物濃度為 10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、57℃退火1 min、72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆?。Cre基因PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，目的基因引物2 μL（引物濃度為10 μm）和內(nèi)參引物1 μL（引物濃度為10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應(yīng)條件為第一階段94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s、65℃退火15 s、68℃延伸10 s，10個循環(huán)；第二階段94℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸10 s，10個循環(huán)；第三階段72℃延伸2 min，10℃保存?zhèn)溆?。兩種基因PCR反應(yīng)終產(chǎn)物（6 μL/孔）進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4 胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠敲除效果驗證 對8周齡目的基因鼠（KO）和對照組鼠（Control）連續(xù)腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）1周，于第12周時處死小鼠，取小鼠一部分胰腺組織提取RNA和總蛋白，剩余胰腺組織制成石蠟切片。按照常規(guī)QPCR、Western blot、免疫熒光步驟進行DEPTOR基因敲除效果的驗證。

2 結(jié)果

2.1 DEPTORloxp/loxp、Cre+/-和 DEPTORloxp/loxpCre+/-小鼠繁殖及鑒定情況 DEPTORloxp/loxp小鼠純合子自交繁殖，依據(jù)遺傳定律，其子代小鼠的基因型均DEPTORloxp/loxp純合小鼠，從引進開始繁殖10個月，共繁殖34只DEPTORloxp/loxp純合小鼠，子代小鼠皮膚及毛發(fā)均為黑色，部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖1；Cre小鼠（黑色）和野生型C57小鼠（黑色）雜交，共獲得子代41只，其中重組酶Cre表達陽性的小鼠22只（占總數(shù)53.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖2；DEPTORloxp/loxp與Cre小鼠雜交獲得F1代58只，其中F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠30只（占總數(shù)51.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖 3；DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠與 DEPTORloxp/loxp鼠雜交，共獲得F2代鼠43只，其中DEPTORloxp/loxp?Cre+/-10只（占總數(shù)23.3%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖4。

圖1 DEPTORloxp/loxp小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR genotyping results of DEPTORloxp/loxpmice

圖2 表達Cre重組酶小鼠基因PCR型鑒定結(jié)果Fig.2 PCR genotyping results of Cre recombinase mice

圖3 F1代小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR genotyping results of the first?generation offsprings

2.2 QPCR、Western blot、免疫熒光驗證DEPTOR基因敲除效果 提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)特異性引物（表1B）進行定量PCR檢測（QPCR），提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織蛋白進行Western blot檢測。由結(jié)果圖5可見，KO小鼠DEPTOR mRNA（A）與蛋白（B）表達水平低于Control小鼠，差異顯著（Mean±SD，n=3）。**P＜ 0.05；進一步驗證DEPTOR敲除效果是發(fā)生在胰島β細胞，進行免疫熒光雙標染色，結(jié)果如圖5可見DEPTOR基因主要表達在胰腺導(dǎo)管，但在胰島β細胞中也有表達，且DEP?TOR基因表達量Control小鼠（C圖）要明顯高于KO小鼠（D圖）。

圖4 F2代小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR genotyping results of the second?generation offsprings

圖5 QPCR、Western blot、免疫熒光(20 ×)驗證DEPTOR基因敲除效果Fig.5 QPCR、Western blot and Immunofluorescence(20 ×)were applied to identify the knockout effect of DEPTOR gene

表1 基因型鑒定（A）和QPCR（B）的引物信息Tab.1 Primer Information for genotyping（A）and QPCR（B）

3 討論

隨著對基因組學的研究深入，基因敲除技術(shù)的使用也越來越普遍，通過建立穩(wěn)定的實驗動物基因敲除模型是研究基因功能的常規(guī)策略。本文所提及的條件性基因敲除是利用Cre/Loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)基因打靶的方法。Cre重組酶由Cre基因編碼，類似于一把基因剪刀，可識別特異DNA序列（如Loxp位點），可剪切掉Loxp位點之間的靶基因，從而達到靶基因敲除的目的。條件性基因敲除所指的是對Cre基因進行調(diào)控，在Cre基因插入特定的可被調(diào)控的啟動子序列，即可人為的控制Cre基因的表達，從而可以在時間和空間研究某個特定基因的功能。

在人體，DEPTOR基因位于第八號染色體，8q24，12，分子量 48 kDa，是一類在 mTORCl和mT0RC2均含有的結(jié)合蛋白，以其PDZ域與mTOR相互作用。DEPTOR作為mTOR家族的一個重要成員，對細胞代謝也有著重要的影響。在肌肉中，Baf60c能通過激活DEPTOR介導(dǎo)的Akt/PKB通道促進糖的有氧氧化向糖酵解的肌纖維類型轉(zhuǎn)變［5］。在肝臟，肝DEPTOR缺失改變空腹代謝轉(zhuǎn)變［6］。DEPTOR還通過激活A(yù)kt?PPAR?γ信號軸能促進白色脂肪組織生成［7］。此外，有研究顯示DEPTOR啟動子區(qū)域基因突變與肥胖的兒童和青少年患胰島素抵抗的發(fā)生風險顯著下降相關(guān)［8］。由于對DEPTOR基因與糖代謝及糖尿病的研究多集中在細胞及組織水平，缺乏整體動物水平上的研究。因此，構(gòu)建DEPTOR基因敲除小鼠模型對進一步深入研究DEPTOR的功能極為重要。此外，β細胞的研究在糖尿病研究領(lǐng)域占據(jù)著不可動搖的主導(dǎo)地位。本實驗構(gòu)建了條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，可在不同的時間節(jié)點上在胰島β細胞對DEPTOR基因進行調(diào)控，能更進一步研究DEPTOR基因的功能。

綜上所述，本實驗利用Cre/Loxp重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，該小鼠和正常野生型小鼠在生長速度、繁殖能力等方面無明顯差異，在糖耐量上出現(xiàn)異常。這是國際上首次利用Cre/Loxp技術(shù)構(gòu)建條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為進一步研究DEPTOR基因與糖尿病發(fā)生機制中扮演的角色提供了重要的動物模型。

參考文獻

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