經(jīng)后增殖方對超排卵大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas 通路的影響

陳艷婷 郭新宇 袁秋虹 鄧偉民

1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院內(nèi)六科（廣州510010）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510405）；3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院輔助生殖中心（廣州510010）

子宮內(nèi)膜容受性與胚胎質(zhì)量是體外受精-胚胎移植（IVF?ET）成功與否的兩個重要條件。研究證實(shí)，IVF?ET過程中控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）可能從一定程度損害卵母細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響胚胎基因表達(dá)，降低胚胎質(zhì)量及著床潛能，但其具體機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對如何改善超排卵胚胎質(zhì)量尚未獲得普遍公認(rèn)的研究成果，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)對此做了很多有意義的探索［1-2］，但大都局限于子宮內(nèi)膜容受性的研究，且多為臨床現(xiàn)象的觀察。本課題組前期研究提示經(jīng)后增殖方在相同子宮內(nèi)膜容受性的基礎(chǔ)上提高了胚胎本身的著床能力［3］，結(jié)合該方的方藥分析，我們認(rèn)為其可能是通過改善卵母細(xì)胞質(zhì)量而提高胚胎本身的種植能力，并通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該方可改善COH狀態(tài)下卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，從而促進(jìn)胚胎種植。Fas通路是經(jīng)典細(xì)胞凋亡通路之一，在人體大多數(shù)器官廣泛存在，可介導(dǎo)多種組織細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，將中藥經(jīng)后增殖方與IVF?ET技術(shù)結(jié)合進(jìn)行系統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)研究，通過測定Fas通路上關(guān)鍵凋亡因子Fas、Fasl、Caspase?8、Caspase?3在卵巢組織中的表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討中藥改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的可能作用機(jī)制，為在COH過程中早期中藥干預(yù)，從而改善卵泡質(zhì)量，提高妊娠率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用藥、試劑與儀器 醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士輝凌公司，批號：K18565B）；注射用血促性素（又名孕馬血清促性腺激素，杭州動物藥品廠，批號：110204564）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠藥業(yè)有限公司，批號：160201）；經(jīng)后增殖方（顆粒劑，1包，相當(dāng)于生藥：黨參15 g，白術(shù)12 g，茯苓12 g，甘草6 g，熟地黃12 g，白芍12 g，當(dāng)歸6 g，川芎6 g，菟絲子15 g，鹿角霜20 g，杜仲15 g，山萸肉10 g，川椒3 g。廣東一方制藥廠，批號：Q1704009）。FAS一抗（Abcam公司），F(xiàn)ASL一抗（Affinity Biosciences），Caspase8一抗（Abcam公司），Caspase3一抗（Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG（Jackson公司），BCA蛋白定量試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司），預(yù)染蛋白Marker（Fermantas公司），ECL發(fā)光液（杭州弗德生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI公司），熒光定量PCR檢測試劑盒（Genecopoeia公司），熒光定量PCR儀（ABI公司），微量核酸定量儀（Merinton公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級SD雌性大鼠30只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量180～220 g，由本院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：44002100011623。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，自由取水和攝食，以陰道脫落細(xì)胞涂片檢查動情周期（陰道涂片全為無核角化細(xì)胞，間或有少量上皮細(xì)胞）。使用Ex?cel軟件隨機(jī)分為3組：空白組、陽性組、中藥組，每組10只。中藥組和陽性組于陰道涂片為動情后期（動情周期第3天）時，每日9：00 am腹腔注射醋酸曲普瑞林20 μg/kg，連續(xù)9 d，第9天同時腹腔注射孕馬血清400 U/kg，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）1 000 U/kg?？瞻捉M每日給予等體積生理鹽水腹腔注射。中藥組每日給予臨床等效劑量的經(jīng)后增殖方灌胃（1.5 mg/kg），陽性組與空白組以等體積生理鹽水灌胃。

1.1.3 標(biāo)本取材 腹腔注射HCG 2 h后頸椎脫臼處死大鼠，快速取出雙側(cè)卵巢，經(jīng)液氮速凍5 min后置于-80℃冰箱凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qPCR檢測 qPCR檢測卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA的相對表達(dá)量按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率的一致性，用2-ΔΔCt法分別計(jì)算 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 的相對表達(dá)量。引物序列及PCR產(chǎn)物大小見表1。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primer

1.2.2 Western?blot檢測 Western blot檢測卵巢組織中 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 蛋白的表達(dá)取適量卵巢組織提取總蛋白溶液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定各組蛋白濃度。采用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值（OD）。分別以 Fas/β?actin，F(xiàn)asl/β?actin，Caspase8/β?actin，Cas?pase3/β?actin的相對OD值表示結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較用單因素方差分析，組間的多重比較采用LSD分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠卵巢組織中 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA相對表達(dá)量比較 3組大鼠卵巢組織中 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 相對表達(dá)量陽性組即控制性超排卵組較空白組和中藥組 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平增高，其中，空白組與陽性組具有顯著差異（分別為P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.002）。中藥組Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與陽性組相比差異具有顯著性（分別為P=0.000，P=0.008，P=0.000），但Caspase3 mRNA表達(dá)水平與陽性組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.078）。中藥組Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA相對表達(dá)量與空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 3 組大鼠卵巢組織中 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)量比較 3組大鼠卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 蛋白的表達(dá)陽性組經(jīng)超促排卵干預(yù)后 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)較空白組和中藥組增高，其中空白組與陽性組相比差異具有顯著性（分別為P=0.004，P=0.003，P=0.001，P=0.008）。中藥組Caspase?3蛋白表達(dá)較陽性組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.110），中藥組Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8表達(dá)與陽性組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.046，P=0.048，P=0.042）。中藥組 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)高于空白組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖 1 3組大鼠卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3mRNA相對表達(dá)量比較Fig.1 Expression of Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8 and Caspase?3 mRNA in ovarian tissues of rats

表2 3組大鼠卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)量比較Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

表2 3組大鼠卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)量比較Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

注：與陽性組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n組別陽性組空白組中藥組10 10 10 Fas/β?actin 0.520±0.102#0.308±0.081**0.395±0.024*Fasl/β?actin 0.643±0.060#0.460±0.043**0.540±0.082*Caspase?8/β?actin 0.495±0.010#0.293±0.030**0.390±0.032*Caspase3/β?actin 0.758±0.146 0.415±0.099**0.580±0.170

圖2 3組大鼠卵巢組織中Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達(dá)量比較Fig.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats

3 討論

《素問·上古天真論》云：“二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子也”。腎中精氣充盛，精血充盈，月經(jīng)來潮，具備生育的基本條件。經(jīng)后期的病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為血、陰、精的不足，血?？仗?。經(jīng)后增殖方具有補(bǔ)益氣血，補(bǔ)腎滋陰之功效，全方以四君子湯加四物湯組成補(bǔ)益氣血的主藥；加鹿角霜、山萸肉以補(bǔ)腎滋陰；但陽生方能陰長，故宜選加甘溫補(bǔ)養(yǎng)之品，以陽中求陰，選用杜仲、菟絲子、川椒補(bǔ)腎助陽。全方使氣血旺盛，沖任得滋，胎孕易成。IVF?ET過程中控制性超排卵降低了卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，影響胚胎種植率，導(dǎo)致臨床妊娠率低。本課題組前期研究已表明，中藥經(jīng)后增殖方可提高IVF?ET患者的胚胎種植率和臨床妊娠率，并對經(jīng)后增殖方與控制性超排卵大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行了初步探討［4-5］。因此，為了對經(jīng)后增殖方的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，本研究選取了Fas細(xì)胞凋亡通路進(jìn)行研究。

卵泡是卵巢的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，卵泡的成熟與閉鎖取決于卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的狀態(tài)：顆粒細(xì)胞增殖分化則卵泡成熟，顆粒細(xì)胞凋亡則卵泡閉鎖。顆粒細(xì)胞伴隨著卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟、排卵至受精的全過程，對卵母細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要［7］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和抑制與不同的基因有關(guān)，以Fas系統(tǒng)為代表的死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是其中的重要凋亡途徑之一［8-9］。Fas系統(tǒng)屬于腫瘤壞死因子受體家族，F(xiàn)as是一種細(xì)胞膜糖蛋白，F(xiàn)asL是其同源的Ⅱ型膜蛋白，是其體內(nèi)唯一的天然配體。Fas存在于靶細(xì)胞上，F(xiàn)asL通過三聚體的形式與之相結(jié)合，導(dǎo)致Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（FADD）被激活。相應(yīng)的，F(xiàn)ADD構(gòu)成procaspase?8自我活化一個對接點(diǎn)，Caspase?8是caspase家族的啟動者，caspase家族一旦激活，Caspase?8可激活其他下游caspase蛋白酶。其中，Caspase?3是Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路中的“核心”蛋白酶，是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者［10］。因此，F(xiàn)as?Fasl?FADD?Caspase?8?Caspase?3 通路的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不可逆的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了qPCR和Western Blot技術(shù)檢測Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 和蛋白在大鼠卵巢組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，陽性組即控制性超排卵組，在Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3基因及蛋白的表達(dá)上均呈現(xiàn)出較高表達(dá)，且顯著高于空白組，說明COH過程可導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，這與PARKER和BARROS等的研究結(jié)果一致［11-12］，表明COH可能會損害卵母細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)而影響胚胎質(zhì)量。李婷婷等［13］研究表明，中藥二至天癸顆?？上抡{(diào)腎氣虛不孕患者卵泡液顆粒細(xì)胞Fas基因表達(dá)水平，推測二至天癸顆?？赡苁峭ㄟ^下調(diào)Fas通路的表達(dá)來抑制顆粒細(xì)胞凋亡。蔣帥［14］研究證實(shí)中藥六味地黃免煎顆粒能明顯抑制腎陰虛型IVF?ET患者Fas介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡信號通路，改善卵巢“封藏”功能，提高卵細(xì)胞質(zhì)量，從而提高IVF?ET的臨床妊娠率。但以上研究局限于對臨床腎氣虛及腎陰虛不孕癥患者的觀察，有待進(jìn)一步深入。本實(shí)驗(yàn)中COH大鼠經(jīng)過中藥經(jīng)后增殖方干預(yù)后，卵巢組織中凋亡因子 Fas，F(xiàn)asl，Caspase?8，Caspase?3基因及蛋白表達(dá)均下降，且中藥組與空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明中藥經(jīng)后增殖方可下調(diào)Fas通路關(guān)鍵凋亡因子的表達(dá)水平，抑制超排卵大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且可使其接近于自然排卵大鼠狀態(tài)，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，改善卵泡質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。本實(shí)驗(yàn)對前期研究進(jìn)行了進(jìn)一步的補(bǔ)充，為臨床運(yùn)用中藥經(jīng)后增殖方改善卵母細(xì)胞質(zhì)量提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，中藥經(jīng)后增殖方能下調(diào)超排卵大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas凋亡通路上關(guān)鍵因子基因及其蛋白的表達(dá)，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，因此，推測Fas通路可能是經(jīng)后增殖方改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用靶點(diǎn)之一。

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