BIM 缺失多態(tài)性與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制的關(guān)系

梁紅玲 黃健清 金田恩 李洪勝 姜明 陳忠生 蘭卉 譚小軍

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（廣州 510095）；2廣州醫(yī)科大學(xué)（廣州 510006）；3廣州達安臨床檢驗中心（廣州 510520）

乳腺癌是全球女性發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，耐藥是其居高不下的重要原因之一［1-2］。BIM（Bcl?2 interacting mediator of cell death）是 Bcl?2家族成員之一，在乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和黑色素瘤中具有促進細胞凋亡的作用［3-4］。近期發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性與EGFR（+）NSCLC等腫瘤靶向抑制劑的療效不佳相關(guān)［5］。隨后，更多的研究發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性是非小細胞肺癌、慢性粒細胞白血病、急性粒細胞白血病以及乳腺癌不良預(yù)后的腫瘤分子標志物［6-10］。然而，BIM缺失多態(tài)性與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制的研究鮮見相關(guān)報道。本實驗將篩查出BIM缺失多態(tài)性人乳腺癌細胞株，測定其紫杉醇藥物的敏感性以及檢測BIM在乳腺癌細胞中mRNA及蛋白水平的表達情況，探討B(tài)IM缺失多態(tài)性與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 本研究所用人乳腺癌細胞株（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、T47D）及肺癌細胞株（HCC2279）均為廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細胞庫儲存。RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibcol公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（BioInd公司）；紫杉醇（Selleck.cn）；MTS試劑及細胞凍存的DMSO（美國Sigma?Aldrich公司）；PCR試劑盒、rtPCR試劑盒（Takara公司）；b?Actin（13E5）Rabbit mAb、Bim（C34C5）Rabbit mAb（Cell signaling Tec。）。

1.2 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細胞株（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、BT549）及肺癌細胞株（HCC2279）用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%FBS）于T25的培養(yǎng)瓶中37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換一次培養(yǎng)液，細胞處于對數(shù)生長期時可用于實驗使用。

1.3 檢測細胞株中BIM缺失多態(tài)性 運用DNA/RNA/Protein Isolation Kit（Omega，Cat R6734）提取各細胞株中的總DNA/RNA/Protein，再通過PCR技術(shù)（Takara，RR030A）擴增目的基因并進一步行基因測序明確目的條帶。PCR引物設(shè)計：野生型：上游引物5′?CCACCAATGGAAAAGGTTCA?3′，下游引物 5′?CTGTCATTTCTCCCCACCAC?3′，缺失型：上游引物與野生型相同，下游引物5′?GCACAGCCTC?TATGGAGAA?3′。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，72℃7 min終延伸，4℃取出。

1.4 rtPCR檢測細胞株的BIM mRNA 吸取上述各細胞株中提取的總RNA，測定RNA純度及含量。使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR047A）逆轉(zhuǎn)mRNA為cDNA。rtPCR擴增以cDNA為模板，按照試劑（Takara，RR420A）說明書進行BIM EX?ON3及EXON4變體表達量的測定。PCR引物設(shè)計：EXON3：上游引物 5′?CAATGGTAGTCATCCT?AGAGG?3′，下游引物5′?GACAAAATGCTCAAGGA?AGAGG?3′，EXON4：上游引物 5′?TTCCATGAGGC?AGGCTGAAC?3′，下游引物5′?CCTCCTTGCATAGT?AAGCGTT?3′，EXON2（內(nèi)參）：上游引物5′?ATGG?CAAAGCAACCTTCTGATG?3′，下游引物5′?GGCTC?TGTCTGTAGGGAGGT?3′。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，72℃7 min終延伸，4℃取出。

1.5 Western Blot檢測細胞株的功能性BIM蛋白 吸取上述各細胞株中提取的總蛋白，經(jīng)Nano?Drop ND?2000超微量分光光度計測定蛋白濃度后加上樣緩沖液并于沸水使蛋白變性。采用SDS?PAGE電泳的方式分離目標蛋白，隨后通過蛋白轉(zhuǎn)印儀半干轉(zhuǎn)法（25 V，3 A，7 min）將其轉(zhuǎn)至PVDF膜。以含5%脫脂牛奶TBST液封閉，再孵育一抗搖床過夜。次日，分別經(jīng)過洗膜、熒光二抗孵育、再次洗膜后，于Odyssey CLx近紅外雙色激光成像系統(tǒng)曝光。

1.6 MTS測定細胞株的紫杉醇IC50收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為50 000個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液（每孔5 000個細胞），置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后第2天，加入100 μL用含10%血清的培養(yǎng)基配制的不同濃度梯度的化療藥物（紫杉醇）。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL?MTS（5 mg/mL），培養(yǎng)3～4 h后終止培養(yǎng)。隨后通過檢測吸光值，確定各細胞株對藥物的IC50值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。兩兩比較采用Student′st檢驗。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人乳腺癌細胞株中BIM缺失多態(tài)性的突變情況 T47D與HCC2279均具有BIM缺失多態(tài)性（PCR產(chǎn)物為285及363 bp），與文獻報道肺癌細胞株HCC2279的檢測結(jié)果相一致［5］。而MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435則為BIM野生型乳腺癌細胞株（PCR產(chǎn)物為363 bp）（圖1）。

圖1 BIM缺失多態(tài)性PCR（A）與基因測序檢測結(jié)果（B）Fig.1The PCR detection result（A）and direct sequencing result（B）of Bim deletion polymorphism

2.2 BIM mRNA及功能性BIM蛋白在乳腺癌細胞株的表達情況 乳腺癌細胞株中（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、T47D），BIM mRNA EXON3：EXON4比值在T47D（BIM突變型）中比值較高，而在其余細胞株中則比值較低（P＜0.05，圖2A）。與此同時，功能性 BIM 蛋白（BimEL、BimL、BimS）在T47D（BIM突變型）中表達下調(diào)，而在其余細胞株中則有較高水平的表達（P＜0.05，圖2 B）。

2.3 BIM缺失多態(tài)性與紫杉醇敏感性的關(guān)系 本研究選用了乳腺癌常見的Luminal A型（ER、PR陽性，HER?2陰性）的T47D（BIM突變型）、MCF?7（BIM野生型）乳腺癌細胞株作為實驗?zāi)Ｐ停?1-12］。結(jié)果示BIM突變型細胞株（T47D，IC50＞30 μmol/L）相對野生型細胞株［MCF?7，IC50=（0.16 ± 0.02）μmol/L］對紫杉醇藥物敏感性顯著較低，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.05，圖3）。

圖2 各乳腺癌細胞株BIM mRNA EXON3：EXON4比值（A）與功能性BIM蛋白的表達情況（B）Fig.2 The ratio of BIM EXON3 to EXON4（A）and the levelof functional BIM protein（B）in breast cancer cell lines

2.4 BIM缺失多態(tài)性與紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制的關(guān)系 在相同紫杉醇濃度作用下，伴隨時間的變化，采用rtPCR測定BIM mRNA EXON3：EXON4比值。結(jié)果示T47D（BIM突變型）EXON3：EXON4比值隨紫杉醇作用時間變化而逐漸增大，MCF?7（BIM野生型）則逐漸減?。≒＜0.05，圖4 A）。同時，在相同時間不同濃度紫杉醇作用下，Western Blot測定T47D的功能性BIM蛋白（BimEL）的表達較MCF?7逐漸減少（P＜0.05，圖4 B）。

3 討論

BIM是Bcl?2家族成員之一，屬于BH3?only蛋白，是參與調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要介質(zhì)［13-14］。近期，Ng等通過末端測序技術(shù)篩查CML患者的基因組時發(fā)現(xiàn)，BIM在2號內(nèi)含子中發(fā)生了2 903個堿基對的缺失，且該現(xiàn)象在非小細胞肺癌和慢性髓細胞白血病中與酪氨酸激酶抑制劑內(nèi)源性耐藥機制密切相關(guān)［5］。隨后，在乳腺癌及其多種腫瘤類型中發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性為不良預(yù)后的預(yù)測因子［6-10］。本研究通過篩查，首次發(fā)現(xiàn)了BIM缺失多態(tài)性乳腺癌細胞株T47D，且其突變類型與文獻報道的肺癌細胞株（HCC2279）相一致［5］。同時，MTS測定結(jié)果示，同為Luminal A型的T47D細胞株（BIM突變型）較MCF7細胞株（BIM野生型）對紫杉醇敏感性顯著較低。這表明BIM缺失多態(tài)性可能參與了紫杉醇的內(nèi)源性耐藥機制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BIM缺失多態(tài)性會使得BIM在轉(zhuǎn)錄后選擇性剪切的過程中更傾向于剪切EXON3（編碼終止子/多聚A尾）而非EXON4（編碼BH3同源結(jié)構(gòu)域），導(dǎo)致其所編碼翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物Bimγ中只含有動力蛋白結(jié)合區(qū)域，卻缺失BH3同源結(jié)構(gòu)域和C端疏水序列，然而BH3同源結(jié)構(gòu)域是BH3?only蛋白中發(fā)揮促凋亡作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［5，15-17］。而在本研究的rtPCR及Western Blot結(jié)果中，T47D（BIM突變型）較其他野生型細胞株，BIM mRNA EXON3：EX?ON4比值高且功能性BIM蛋白表達下調(diào)。與此同時，相對MCF7（BIM野生型）而言，在紫杉醇作用下T47D（BIM突變型）BIM mRNA EXON3：EXON4比值隨時間的推移逐漸增高，而功能性BIM蛋白（BimEL）則逐漸下調(diào)。該現(xiàn)象表明，BIM缺失多態(tài)性在乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制中的作用可能與Ng等在非小細胞肺癌中的推斷是相一致的。BIM缺失多態(tài)性在乳腺癌中可通過影響B(tài)IM mRNA選擇性剪切的過程，致使轉(zhuǎn)錄出大量含有EXON3的BIM mRNA，進而翻譯出無功能性的BIM蛋白（Bimγ），從而削弱了內(nèi)源性凋亡途徑的作用，使得乳腺癌腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性降低，導(dǎo)致內(nèi)源性耐藥的發(fā)生。其次，最近的研究發(fā)現(xiàn)BH3模擬劑（ABT?737 or ABT?263）［5］和HDAC抑制劑（Vorinostat）［18］具有逆轉(zhuǎn)BIM缺失多態(tài)性所致內(nèi)源性耐藥的作用。前者是模擬了Bad的BH3結(jié)構(gòu)域，而后者則是通過介導(dǎo)啟動子區(qū)域的組蛋白乙?；龠MBH3?only蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達，從而克服耐藥發(fā)生。其機制都是通過增強BH3?only蛋白（Bim、Bid、Bad、Bik）的作用來促進內(nèi)源性凋亡途徑，側(cè)面也論證了BIM缺失多態(tài)性可能是通過削弱內(nèi)源性凋亡途徑，從而介導(dǎo)內(nèi)源性耐藥機制的發(fā)生。

綜上所述，BIM缺失多態(tài)性可能與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機制密切相關(guān)。然而，本研究為細胞體外實驗，且相關(guān)研究較少，其結(jié)論仍有待細胞動物實驗及臨床觀察的進一步論證。

參考文獻

［1］GRAY J M，RASANAYAGAM S，ENGEL C，et al.State of the evidence 2017：an update on the connection between breast cancer and the environment［J］.Environ Health，2017，16（1）：94?155.

［2］林思園，李磊，張利華.阻斷PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細胞株MCF?7/ADR的多藥耐藥［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（5）：709?711.

［3］SIONOV R V，VLAHOPOULOS S A，GRANOT Z.Regulation of bim in health and disease［J］.Oncotarget，2015，6（27）：23058?23134.

［4］WOODS N T，YAMAGUCHI H，LEE F Y，et al.Anoikis，initi?ated by Mcl?1 degradation and Bim induction，is deregulated during oncogenesis［J］.Cancer Res，2007，67（22）：10744?10752.

［5］NG K P，HILLMER A M，CHUAH C T，et al.A common BIM deletion polymorphism mediates intrinsic resistance and inferior responses to tyrosine kinase inhibitors in cancer［J］.Nat Med，2012，18（4）：521?528.

［6］AUGIS V，AIRIAU K，JOSSELIN M，et al.A single nucleotide polymorphism in cBIM is associated with a slower achievement of major molecular response in chronic myeloid leukaemia treat?ed with imatinib［J］.PloS One，2013，8（11）：e78582.

［7］KO T K，CHIN H S，CHUAH C T，et al.The BIM deletion poly?morphism：A paradigm of a permissive interaction between germLine and acquired TKI resistance factors in chronic my?eloid leukemia［J］.Oncotarget，2016，7（3）：2721?2733.

［8］LIN C H，SHEN C Y，LEE J H，et al.High prevalence of the BIM deletion polymorphism in young female breast cancer in an east asian country［J］.PloS One，2015，10（4）：e0124908.

［9］SOH S X，SIDDIQUI F J，ALLEN J C，et al.A systematic review and meta?analysis of individual patient data on the impact of the BIM deletion polymorphism on treatment outcomes in epidermal growth factor receptor mutant lung cancer［J］.On?cotarget，2017，8（25）：41474?41486.

［10］YING H Q，CHEN J，HE B S，et al.The effect of BIM deletion polymorphism on intrinsic resistance and clinical outcome of cancer patient with kinase inhibitor therapy［J］.Sci Rep，2015，5：11348.

［11］SUBIK K，LEE J F，BAXTER L，et al.The expression patterns of ER，PR，HER2，CK5/6，EGFR，Ki?67 and AR by immuno?histochemical analysis in breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer（Auckl），2010，4：35?41.

［12］紀光偉.精準醫(yī)療時代的乳腺癌治療［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（9）：1369?1372.

［13］ADACHI M，ZHAO X，IMAI K，et al.Nomenclature of dynein light chain ?linked BH3 ?only protein Bimisoforms［J］.Cell Death Differ，2005，12（2）：192?193.

［14］O′CONNOR L，STRASSER A，O′REILLY L A，et al.Bim：a novel member of the Bcl?2 family that promotes apoptosis［J］EMBO J，1998，17（2）：384?395.

［15］TAN T T，DEGENHARDT K，NELSON D A，et al.Key roles of BIM?driven apoptosis in epithelial tumors and rational chemo?therapy［J］.Cancer cell，2005，7（3）：227?238.

［16］ZHANG L N，LI J Y，XU W，et al.A review of the role of Pu?ma，Noxa and Bim in the tumorigenesis，therapy and drug re?sistance of chronic lymphocytic leukemia［J］.Cancer Gene Ther，2013，20（1）：1?7.

［17］CHENG，E H SAWYERS C L.In cancer drug resistance，germ?Line matters too［J］.Nat Med，2012，18（4）：494?496.

［18］NAKAGAWA T，TAKEUCHI S，YAMADA T，et al.EGFR?TKI resistance due to BIM polymorphism can be circumvented in combination with HDAC inhibition［J］.Cancer Res，2013，73（8）：2428?2434.