Aurora蛋白激酶抑制劑VX-680對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞間同質(zhì)黏附力和遷移能力的影響*

任本洪， 孫雪嬌， 郝躍鵬， 寇俊婷， 牛仕詩(shī)， 楊成園， 王曉霞

(山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 山西 太原 030001)

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病率高、侵襲性高、易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，死亡率居全球惡性腫瘤第2位，僅次于肺癌[1]。肝癌具有高復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，有研究表明，肝癌術(shù)后1年和2年復(fù)發(fā)率分別為42.8%和38.8%[2]；5年復(fù)發(fā)率可達(dá)60%左右[3]。因此，對(duì)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋求有效抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的藥物已成為當(dāng)今肝癌研究的一個(gè)方向。

Aurora蛋白激酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 由Aurora A、B和C 3個(gè)成員組成，它們?cè)诖呋Y(jié)構(gòu)域中具有67%～76%的氨基酸序列同一性，僅僅在NH2末端有所不同[4]，分別發(fā)揮著不同的生物功能。近年來(lái)研究表明，在卵巢癌[5]、胃癌[6]和乳腺癌[7]中均存在Aurora激酶的高表達(dá)。研究Aurora激酶在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理，對(duì)研發(fā)腫瘤靶向藥物具有重要的臨床意義。例如AZD-1152(barasertib)、MLN-8237(alisertib)和VX-680(tozasertib)[8]幾個(gè)Aurora蛋白激酶抑制劑已步入臨床試驗(yàn)階段。據(jù)報(bào)道，VX-680能夠與Aurora蛋白激酶結(jié)合使Aurora A和B激酶的活性降低[9]，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止和細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。然而關(guān)于VX-680對(duì)HepG2細(xì)胞間黏附能力及遷移能力的影響，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究將有助于闡明VX-680 的作用機(jī)制，從而為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HepG2由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存。

1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone；瓊脂粉購(gòu)于北京索萊寶有限公司；VX-680購(gòu)于Merck，用DMSO溶解并貯存。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn)[10]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化傳代于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)，分別向其中加入不同濃度(3.125 μmol/L，6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680，放于孵箱中孵育48 h；消化細(xì)胞并加入提前用瓊脂鋪好的96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，在孵箱中孵育12 h，觀察細(xì)胞聚集情況，拍照并計(jì)算各組形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)。

2.3細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)[11]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化傳代于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)，加入不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680作用48 h；常規(guī)消化細(xì)胞于48孔板中鋪板，每組設(shè)置10個(gè)平行孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，分別用含1 mmol/L EDTA(TE)的0.2%胰酶及1 mmol/L CaCl2(TC)的0.2%胰酶處理細(xì)胞，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)總數(shù)(N)，并用 NTC/NTE值來(lái)表示細(xì)胞分散程度。

2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 常規(guī)消化不同濃度 (3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L) VX-680作用24 h后的HepG2細(xì)胞，使其濃度為1×109/L，接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合長(zhǎng)滿(mǎn)后，用200 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字垂直劃痕，用PBS洗2次，然后加入無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后取出，倒置顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus軟件測(cè)量劃痕寬度。

2.5Western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入含有PMSF的細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解40 min，每隔10 min輕彈1次，以防結(jié)冰，12 000 r/min 離心20 min收集上清液，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。采用 SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白分離后，轉(zhuǎn)至0.45 μm NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入稀釋好的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-actin Ⅰ抗，4 ℃搖床過(guò)夜，PBST洗膜3次，加入相應(yīng)的 Ⅱ 抗室溫?fù)u床孵育2 h，PBST洗膜3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光成像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨著VX-680濃度的增加，細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)減少，體積增大，團(tuán)塊越來(lái)越致密；而對(duì)照組細(xì)胞聚集形成的團(tuán)塊較多，體積較小，且疏松。通過(guò)計(jì)數(shù)每組的細(xì)胞團(tuán)數(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組所形成的細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)為63.67±7.2，而實(shí)驗(yàn)組不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680所形成的細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)分別為24.67±3.5、14.0±3.0和1.3±0.6，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且各實(shí)驗(yàn)組間差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞間的細(xì)胞聚集能力明顯高于對(duì)照組，并且聚集能力隨VX-680濃度的增加逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Aggregation ability of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations observed under inverted microscope. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖1不同濃度VX-680作用HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞聚集情況

2 細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用含1 mmol/L EDTA的胰酶處理后，VX-680各濃度組的HepG2細(xì)胞大多分散成單個(gè)，各組細(xì)胞的分散程度幾乎沒(méi)有差異；用含1 mmol/L CaCl2的胰酶處理后，與對(duì)照組相比，隨著VX-680濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組所形成的細(xì)胞團(tuán)塊越來(lái)越大。經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組NTC/NTE值為(0.90±0.13)；而不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680處理組NTC/NTE比值分別為0.48±0.07、0.34±0.03和0.19±0.01，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且各實(shí)驗(yàn)組間差別亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間的細(xì)胞黏附能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組，并且黏附能力隨著VX-680濃度的增加逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞越來(lái)越不容易被分散，見(jiàn)圖2。

3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后0 h，對(duì)照組和VX-680各濃度組的劃痕寬度基本相同，48 h后，對(duì)照組的劃痕基本愈合，而VX-680各濃度組細(xì)胞的劃痕愈合延遲，并且隨著VX-680濃度的升高，細(xì)胞劃痕的愈合能力逐漸降低，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且各實(shí)驗(yàn)組間差別亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明VX-680能夠抑制HepG2細(xì)胞的遷移，見(jiàn)圖3。

4 Western blot檢測(cè)VX-680的HepG2細(xì)胞中黏附分子E-cadherin的蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DMSO和不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680作用于HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平隨著VX-680濃度的增加而升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

Aurora激酶在大多數(shù)惡性腫瘤中均存在高表達(dá)，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌和胰腺癌等。Aurora激酶的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。VX-680可以抑制Aurora激酶的活性，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

Figure 2. Dissociation of the HepG2 cells treated with different concentration of VX-680. A: the dissociation ability of the HepG2 cells detected by the method of exposure to trypsin in the presence of EDTA or CaCl2(×200); B: the cell dissociation index (NTC/NTE). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖2不同濃度VX-680作用的HepG2細(xì)胞分離情況

Figure 3. The effects of VX-680 at different concentrations on the migration ability of HepG2 cells. A: the representative pictures of wound healing assay (×100); B: the scratch width of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖3不同濃度的VX-680對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響

Figure 4. The protein levels of E-cadherin in the HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs3.125 μmol/L group;#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖4不同濃度的VX-680作用下HepG2細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展往往與細(xì)胞行為的改變有關(guān)。大量的研究顯示，腫瘤細(xì)胞間黏附力的下降是造成腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和轉(zhuǎn)移的首要原因，鈣黏蛋白是一類(lèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附的鈣依賴(lài)性跨膜糖蛋白，其中上E-cadherin能以嗜同性方式(同種分子間拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合)介導(dǎo)同型細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附。當(dāng)E-cadherin失活時(shí)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。本實(shí)驗(yàn)主要采用細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn)和分離實(shí)驗(yàn)闡明了VX-680對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞間黏附能力的影響。細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)用瓊脂包被培養(yǎng)皿的方式模擬細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下發(fā)生聚集的情況，通過(guò)顯微鏡下觀察細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán)塊的大小、數(shù)量，來(lái)判斷細(xì)胞間黏附力的強(qiáng)弱。細(xì)胞間黏附力強(qiáng)，所形成的細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)少，團(tuán)塊較大且緊密。細(xì)胞間黏附力降低時(shí)，所形成的細(xì)胞團(tuán)塊相對(duì)多，團(tuán)塊較小且疏松[14]。細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)主要是基于E-cadherin對(duì)Ca2+的依賴(lài)性而設(shè)計(jì)的。首先，我們分別用含EDTA(TE)及 CaCl2(TC)的胰酶處理細(xì)胞。用含EDTA(TE)的0.2%胰酶處理細(xì)胞后，由于EDTA可以螯合金屬陽(yáng)離子Ca2+而抑制Ca2+依賴(lài)型鈣黏蛋白E-cadherin所介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間黏附，使細(xì)胞間連接破壞，細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞。用含CaCl2(TC)的0.2%胰酶處理細(xì)胞后，由于Ca2+的存在E-cadherin的黏附功能可以正常發(fā)揮，單層細(xì)胞被分散為單個(gè)細(xì)胞的能力減弱，細(xì)胞團(tuán)塊增多。也就是說(shuō)，隨著E-cadherin功能的增強(qiáng)，細(xì)胞越來(lái)越不容易被分散為單個(gè)細(xì)胞。因此可以用NTC/NTE來(lái)反映E-cadherin的功能[15-18]。NTC/NTE值越小，E-cadherin的功能越強(qiáng)，細(xì)胞間黏附能力越強(qiáng)。通過(guò)細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞聚集能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞的分散能力顯著降低；并且隨著VX-680濃度的升高，細(xì)胞間的聚集能力逐漸增強(qiáng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)HepG2細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)隨著VX-680濃度的升高而增加。另外，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VX-680可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移。

綜上所述，Aurora蛋白激酶抑制劑VX-680能夠增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞間的同質(zhì)黏附力，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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