Calreticulin通過誘導(dǎo)細(xì)胞EMT促進(jìn)鼻咽癌遷移和侵襲*

朱軍輝， 金 明， 邱 浩， 張和良， 馬 為， 肖 玄， 李承松， 羅招陽， 張志偉△

(南華大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所， 腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系， 湖南 衡陽 421001)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的惡性腫瘤[1]。NPC細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)與預(yù)后差的最主要原因，在NPC中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是其侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[2]。EMT與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT的發(fā)生常伴隨多個(gè)細(xì)胞分子標(biāo)志物改變，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)的下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)的表達(dá)上調(diào)等[3]。前期我們通過蛋白組學(xué)方法篩選鑒定出EMT相關(guān)蛋白質(zhì)——鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)[4]。CRT是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐蛋白，在包括乳腺癌、胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的遷移侵襲密切相關(guān)[5]。本文檢測CRT在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并探究CRT表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞EMT及遷移侵襲的影響。

材 料 和 方 法

1 病例資料

收集湖南省腫瘤醫(yī)院病理科44例鼻咽癌組織、24例鼻咽部息肉增生及炎癥、30例鼻咽部乳頭狀瘤組織，另有8例鼻咽癌組織來自南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，3例鼻咽部炎癥黏膜來自南華大學(xué)病理教研室。鼻咽癌組織中鱗狀細(xì)胞癌45例，基底細(xì)胞癌3例，腺樣囊性癌2例，未分化癌2例；患者年齡32～79歲，平均年齡52.5歲，其中男性37例，女性15例；I期20例(38.5%)；II～I(xiàn)II期32例(61.5%)。鼻咽部非癌組織中，男性41例，女性16例，年齡31～77歲，平均年齡55.3歲。

2 實(shí)驗(yàn)材料

鼻咽癌CNE2細(xì)胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供。用含10%胎牛血清(杭州四季青)的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)。

CRT基因小干擾RNA(CRTsmall interfering RNA，si-CRT)購自廣州銳博公司；抗CRT抗體購自CST；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β抗體購自Epitomics；抗E-cadherin和vimentin抗體購自中杉金橋公司；S-P法免疫組織化學(xué)染色試劑盒購于福建邁新生物公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1免疫組化檢測calreticulin的表達(dá) 按免疫組化S-P法對鼻咽癌組織和鼻咽部良性病變組織切片行抗原修復(fù)，I 抗 calreticulin(1∶500)4 ℃孵育過夜。DAB顯色。復(fù)染、沖洗、分化、返藍(lán)、脫水、封片。隨機(jī)選取每張切片的4個(gè)視野(×400)，IPP 6.0軟件計(jì)算每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，用分值表示：不表達(dá)為0分，≤10%為1分，10%～50%為2分，≥50%為3分。染色強(qiáng)度無色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。采用積分綜合計(jì)量，總分值=著色強(qiáng)度分值×著色細(xì)胞分值?？偡种禐?表示陰性表達(dá)，1～3分為陽性表達(dá)。著色癌細(xì)胞數(shù)>5%判斷為陽性。

3.2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將生長狀態(tài)良好的CNE2細(xì)胞以每孔2×105接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA (si-control)為對照組。轉(zhuǎn)染24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，收集蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3Western blot檢測蛋白水平 收集細(xì)胞，充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。將蛋白進(jìn)行8% SDS-PAGE分離(β-actin為10%分離膠)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉， I抗[calreticulin(1∶4 000)，E-cadherin和MMP-9(1∶1 500)，TGF-β(1∶1 500)，vimentin(1∶2 000),β-actin(1∶1 500)]孵育過夜，洗膜，II 抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，洗膜、發(fā)光、壓片、曝光、顯影與定影，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算待測蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

3.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 纖維連接蛋白(10 mg/L)處理Transwell小室底部膜30 min。隨后在小室上部(每組置3復(fù)孔)加入無血清的細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞密度為2×108/L)。24孔板下室加入500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，清洗小室、4%多聚甲醛固定。Transwell小室底部膜切割下來，30%甘油封片。0.1%結(jié)晶紫對下室的每孔進(jìn)行染色。倒置顯微鏡下對微孔過濾器下層的每個(gè)樣本中央及周邊進(jìn)行計(jì)數(shù)，用400倍顯微觀察，同時(shí)隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析。

3.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室的上室面用Matrigel (1 g/L;BD)包被，37 ℃溫箱放置1 h使Matrigel形成凝膠。其余步驟及計(jì)數(shù)方法基本同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，以侵入微孔過濾器下的侵襲細(xì)胞的平均數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，t檢驗(yàn)作2組之間的比較，相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Calreticulin在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況

S-P免疫組化法結(jié)果表明:calreticulin在鼻咽癌組織的陽性表達(dá)率(43/52，82.69%)較鼻咽部良性病變組織的陽性表達(dá)率(11/57，19.29%)顯著增高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of calreticulin in nasopharyngeal carcinoma tissues and benign tissues detected by the me-thod of immunohistochemistry (×400). A: benign tissue; B: nasopharyngeal carcinoma tissue.

圖1Calreticulin在鼻咽癌組織及良性病變組織中的表達(dá)情況

2 Calreticulin在鼻咽癌組織中表達(dá)的意義

本研究發(fā)現(xiàn)，在52例鼻咽癌樣本中，臨床分期為II～I(xiàn)II期和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中calreticulin的表達(dá)陽性率均分別高于臨床分期為I期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織(P<0.05)。相關(guān)分析顯示CRT表達(dá)與鼻咽癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但是calreticulin陽性率在不同性別和不同年齡的患者當(dāng)中并無差別，見表1。

表1Calreticulin與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Table 1. The relationship between calreticulin and clinicopathological parameters

ClinicopathologicalparametersnCalreticulinexpressionrPSex Male3731(83.78%)0.0870.450 Female1512(80.00%)Age ≥601411(78.57%)0.0750.574 <603832(84.21%)Clinicalstage I2012(60.00%)0.4570.013 II～I(xiàn)II3231(96.87%)Lymphaticmetastasis Yes3332(96.96%)0.3820.018 No1911(57.89%)

3 Calreticulin低表達(dá)對CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響

轉(zhuǎn)染si-control的對照組細(xì)胞為扁長梭形和紡錘體樣形態(tài)，細(xì)胞排列較松散；轉(zhuǎn)染si-CRT 48 h后部分細(xì)胞由原來的長梭形和紡錘體樣轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形和鵝卵石樣形態(tài)，細(xì)胞排列緊密，見圖2。

Figure 2. The morphological changes of the CNE2 cells (48 h after transfection, ×200).

圖2si-CRT轉(zhuǎn)染48h后光鏡下觀察CNE2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

4 CRT低表達(dá)對vimentin、MMP-9、TGF-β和E-cadherin表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染si-CRT 48 h后，Western blot結(jié)果顯示，敲降CRT表達(dá)后，與對照組相比，CNE2細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而vimentin、MMP-9和TGF-β蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

5 CRT低表達(dá)對CNE2細(xì)胞遷移與侵襲的影響

轉(zhuǎn)染si-CRT 48 h后，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示calreticulin低表達(dá)組遷移細(xì)胞和侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，遷移率和侵襲率低于對照組，提示calreticulin低表達(dá)后CNE2細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Western blot results for determining EMT-related proteins (48 h after transfection).*P<0.05，**P<0.01vssi-control group.

圖3EMT相關(guān)蛋白的Westernblot檢測結(jié)果

Figure 4. The migration and invasion abilities of CNE2 cells detected by Transwell assay (48 h after transfection, ×400).**P<0.01vssi-control group.

圖4Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

大量研究表明CRT在人類多種疾病，尤其是惡性腫瘤中異常表達(dá)。在乳腺癌[6]和胃癌[7]的研究中發(fā)現(xiàn)CRT 呈過表達(dá)，且CRT的表達(dá)水平與它們的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Lee等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，CRT表達(dá)上調(diào)與腫瘤大小和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胰腺癌中CRT通過MEK/ERK信號通路的激活來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[8]?？梢奀RT在多種腫瘤中存在表達(dá)上調(diào)，CRT表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、遷移、侵襲密切相關(guān)。綜合上述研究結(jié)果，我們推測CRT與鼻咽癌細(xì)胞EMT密切相關(guān)。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測鼻咽癌和鼻咽良性病變組織中CRT蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中CRT蛋白表達(dá)明顯增高，其表達(dá)與鼻咽癌臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明CRT蛋白可能參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程，CRT表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。有趣的是在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，CRT高表達(dá)與更好的病理學(xué)分化類型相關(guān)，CRT陽性患者5年生存率遠(yuǎn)高于CRT陰性患者[9]；在漿液性卵巢癌中，CRT表達(dá)陽性的患者對化療更為敏感[10]。因此，CRT的功能具有雙重性，對腫瘤形成和進(jìn)展的影響可能取決于不同的細(xì)胞類型和臨床階段。

腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移涉及許多不同的過程，EMT作為其中關(guān)鍵的步驟，被認(rèn)為鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[2]。先前的研究已經(jīng)表明在胃癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌中CRT過表達(dá)有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前缺乏CRT直接調(diào)控EMT的證據(jù)。整合素依賴路徑可能是其中的一種，CRT是少數(shù)可以直接與整合素α亞基結(jié)合的胞質(zhì)蛋白，在鈣網(wǎng)蛋白高表達(dá)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣細(xì)胞中，整合素依賴的細(xì)胞黏附明顯受到了影響，CRT可能通過與整合素α的結(jié)合影響EMT的發(fā)生[11]。有研究表明表達(dá)不同水平的鈣網(wǎng)蛋白，對細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白尤其是纖連蛋白的合成影響顯著，鈣網(wǎng)蛋白通過調(diào)節(jié)纖連蛋白表達(dá)和ECM沉積介導(dǎo)細(xì)胞黏附[12]。EMT發(fā)生時(shí)常伴隨ECM蛋白的改變，如纖連蛋白的上調(diào)，這表明CRT可能通過調(diào)控ECM的表達(dá)影響EMT。另外，CRT通過調(diào)控多條信號通路介導(dǎo)EMT的發(fā)生。TGF-β信號通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的經(jīng)典通路，最新的研究表明，CRT能夠與TGF-β受體Ⅰ和Ⅱ相互作用，在CRT的存在下，TGF-β通過介導(dǎo)糖原合成酶激酶3β的失活，促進(jìn)Snail2/Slug對E-cadherin的抑制[13]。在Madin-Darby犬腎細(xì)胞中過表達(dá)CRT后，轉(zhuǎn)錄因子Slug與E-cadherin啟動子區(qū)域的E盒順式作用元件結(jié)合增強(qiáng)，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，即CRT通過Slug/E-cadherin通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。另外，CRT還能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57相互作用形成復(fù)合體，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57參與調(diào)控EMT相關(guān)受體EGFR的內(nèi)化和磷酸化，EGFR誘導(dǎo)EMT的信號通路可能是CRT調(diào)控EMT的一種路徑[15-17]。我們前期構(gòu)建了CRT高表達(dá)載體，觀察到CNE2細(xì)胞過表達(dá)CRT后發(fā)生EMT改變，其遷移侵襲能力增強(qiáng)[18]。本研究通過構(gòu)建si-CRT干擾載體抑制CNE2細(xì)胞中CRT表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱，CNE2細(xì)胞的EMT受到抑制。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)與大多數(shù)實(shí)體腫瘤一樣，鼻咽癌組織中CRT高表達(dá)，且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。CRT可通過誘導(dǎo)EMT的發(fā)生促進(jìn)鼻咽癌的惡性表型轉(zhuǎn)化。目前，CRT促腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以及相關(guān)信號通路等尚不清楚，其在鼻咽癌治療中的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步深入研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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