黃芩素對野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠血管壁增厚的抑制作用*

朱迪穎， 王 暢， 付乃潔， 劉臨紅， 張慧豐， 梁月琴， 師銳贊△， 張明升△

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1藥理教研室， 2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 山西 太原 030001)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一種破壞性極強(qiáng)的心肺疾病，發(fā)病率和死亡率均高[1]。其關(guān)鍵的病理變化是肺小動(dòng)脈重構(gòu)、肺微血管床的不斷減少和血管阻力的進(jìn)行性增高，最終導(dǎo)致右心室肥大、心力衰竭甚至死亡[2]。目前臨床上用于治療PAH的主要藥物有內(nèi)皮素、一氧化氮和前列環(huán)素等，雖然這些藥物可以緩解PAH癥狀，但它們均不能抑制血管壁增厚，逆轉(zhuǎn)PAH進(jìn)程，降低病死率[3]。因此臨床上急需一種能夠抑制或逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)，從根本上治愈PAH的藥物。

黃芩素(baicalein)是從黃芩的干根中純化得到的黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗癌等作用[4-5]。近年來多項(xiàng)研究證實(shí)，黃芩素可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，預(yù)防心肌肥厚，改善心臟功能[6-7]。但其在PAH中的作用及機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射野百合堿(monocrotaline，MCT)建立大鼠PAH模型，觀察黃芩素對血管壁增厚的影響及可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(220～250 g)，雄性，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為：SCXK(晉)2009-0001，恒溫恒濕飼養(yǎng)。

2 藥品和試劑

野百合堿(Sigma-Aldrich)；黃芩素(TCI)；Masson染色試劑盒(福建邁新公司)；HE染色試劑盒(武漢博士德公司)；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam)；抗p38、ERK和JNK抗體(Cell Signaling Technology)；抗β-actin抗體(武漢博士德公司)。其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 儀器

臍靜脈導(dǎo)管(Tyco)；光學(xué)顯微鏡(Nikon)；PowerLab 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)和壓力換能器(埃德儀器國際貿(mào)易上海有限公司)；插管操作相關(guān)手術(shù)器械(上海醫(yī)療儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

4 主要方法

4.1動(dòng)物模型制備與分組 28只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(每組7只)：對照組(control組)，野百合堿模型組(MCT組)，黃芩素低劑量組[MCT + baicalein (50 mg/kg)]和黃芩素高劑量組[MCT + baicalein (100 mg/kg)]。除對照組外，所有大鼠一次性皮下注射60 mg/kg MCT(將0.2 g MCT溶解于1 mol/L HCl中，加入1 mol/L NaOH調(diào)整pH至7.4，生理鹽水定容至10 mL)；對照組大鼠注射相同劑量的生理鹽水；MCT+baicalein (50 mg/kg)組大鼠和MCT+baicalein (100 mg/kg)組大鼠于MCT注射2周后灌胃給予黃芩素(用DMSO溶解，加生理鹽水稀釋至所需濃度)，劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d。對照組及MCT組大鼠灌胃等量生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隔日稱 1 次體重，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。

4.2血流動(dòng)力學(xué)和心室重量測定 MCT注射4周后，稱量各組大鼠體重(body weight，BW)，3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取一根3.5號(hào)的臍靜脈導(dǎo)管，連接壓力換能器，將導(dǎo)管從大鼠頸外靜脈插入至右心室，此時(shí)可見振幅較大的右心室波。根據(jù)波形變化，記錄并分析右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。處死動(dòng)物后取出心肺組織，剪去左右心房及大血管，分離右心室(right ventricular，RV)和左心室加室間隔(left ventricular plus septum，LV+S)，濾紙吸干組織并稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI; %)=RV/(LV+S)×100%和右心室質(zhì)量指數(shù)(right ventricular mass index， RVMI; %)=RV/BW×100%。

4.3肺組織Masson染色 將分離的肺組織用4～6 ℃ 生理鹽水沖洗，沿肺門水平橫切取材，4%多聚甲醛固定，48 h后石蠟包埋，用于Masson染色和HE染色。Masson染色時(shí)，將3 μm切片常規(guī)脫蠟至水，然后依次加入Masson復(fù)合染色液、磷鉬酸、苯胺藍(lán)、分化液。之后脫水透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察膠原纖維的分布范圍。

4.4肺動(dòng)脈組織HE染色 肺組織石蠟包埋后切片3 μm，按常規(guī)方法脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，將切片依次放入蘇木素和伊紅染液中染色，自來水返藍(lán)，脫水透明，中性樹膠封片。每組隨機(jī)選取5張染色切片，每張切片選取5個(gè)部分，在光鏡下選取直徑50～150 μm的肺小動(dòng)脈，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量計(jì)算中模厚度占血管直徑的百分比(WT%)和肺血管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)。

4.5Western blot檢測蛋白水平 取肺組織和肺小動(dòng)脈，RIPA裂解液裂解，充分研磨后離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE，半干式法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，之后將膜分別放入α-SMA(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)、p38 (1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、ERK(1∶1 000)、p-JNK(1∶500)、JNK(1∶1 000)和β-actin(1∶2 500)的 I 抗中孵育。4 ℃過夜后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)或辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育；ECL發(fā)光液顯色，Bio-Rad Image Lab凝膠成像系統(tǒng)攝像分析，并用其分析系統(tǒng)軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析，測定灰度值，比較各組間差異。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩素改善MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH

與對照組相比，MCT組的RVSP、RVHI和RVMI均顯著增高(P<0.01)，提示PAH造模成功；與MCT組相比，黃芩素高、低劑量均可抑制RVSP、RVHI及RVMI的升高(P<0.01)，以上結(jié)果表明，黃芩素可改善MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH，見表1。

表1 血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚結(jié)果

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMCT group;++P<0.01vsMCT+baicalein (50 mg/kg) group.

2 黃芩素可減輕MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織纖維化

Masson染色法結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織藍(lán)色膠原纖維呈均勻分布，著色淺淡且范圍小，而MCT組大鼠肺組織上膠原纖維藍(lán)染范圍明顯擴(kuò)大，著色深。黃芩素高、低劑量治療組較MCT組纖維化明顯減輕，見圖1A。α-SMA是組織纖維化的重要指標(biāo)之一，Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，MCT組大鼠肺組織α-SMA表達(dá)顯著增多(P<0.01)，而黃芩素高、低劑量組較MCT組α-SMA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1B。這些結(jié)果表明MCT組大鼠肺組織發(fā)生明顯纖維化，而黃芩素能減輕肺組織纖維化。

3 黃芩素可減輕PAH大鼠的血管壁增厚

HE染色結(jié)果表明，與對照組比較，MCT組的肺動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，WT%和WA%顯著升高(P<0.01)，而黃芩素(50和100 mg/kg)可明顯改善這一病理變化，WT%和WA%均明顯降低(P<0.05)，說明黃芩素可減輕MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈壁增厚，抑制肺血管重構(gòu)，見圖2、表2。

4 黃芩素可抑制MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈MAPK信號(hào)通路的激活

Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，MCT組大鼠肺小動(dòng)脈的p38、ERK和JNK被顯著激活，磷酸化增強(qiáng)(P<0.01)，而高、低劑量的黃芩素均可抑制p38、ERK和JNK的磷酸化(P<0.01),說明黃芩素減輕大鼠肺動(dòng)脈高壓作用可能與抑制MAPK信號(hào)通路有關(guān)，見圖3。

討 論

PAH具有致命性，其主要的病理特征是肺血管重構(gòu)引起肺血管阻力進(jìn)行性升高，從而導(dǎo)致右心室肥厚，右心衰竭甚至死亡。有研究證實(shí)，黃芩素對多個(gè)臟器具有保護(hù)作用，能減輕敗血癥導(dǎo)致的心臟損傷，對心肌缺血和再灌注造成的肝臟損傷也有一定的改善作用[8-9]。黃芩素還可減輕脂多糖造成的急性肺損傷[10]，抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MCT誘導(dǎo)PAH大鼠發(fā)生右心室肥厚、右心衰竭的同時(shí)，也促進(jìn) PAH大鼠肺組織纖維化，而黃芩素 (50和100 mg/kg) 可顯著抑制肺組織炎癥纖維化，改善PAH大鼠心肺功能。

肺血管的異常重構(gòu)是PAH發(fā)生發(fā)展的重要病理特征，抑制血管重構(gòu)是治療PAH的關(guān)鍵[12]。本研究通過觀察肺動(dòng)脈管壁厚度來評估血管重構(gòu)的程度。HE染色發(fā)現(xiàn)，MCT組大鼠的肺血管壁厚度顯著增厚，經(jīng)黃芩素 (50和100 mg/kg) 治療后，血管壁增厚得到明顯改善，WT%和WA%明顯降低，證實(shí)黃芩素可減輕肺動(dòng)脈管壁的增厚，抑制肺血管重構(gòu)。

Figure 1. The degree of pulmonary fibrosis in the rats of the 4 groups. A: the results of Masson staining (×100); B: the protein levels of α-SMA in the rats of the 4 groups were determined by Western blot. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMCT group;+P<0.05vsMCT+bai-calein (50 mg/kg) group.

圖1Masson染色和Westernblot法觀察4組大鼠的肺組織纖維化程度

雖然導(dǎo)致PAH的確切分子機(jī)制尚不清楚，但愈來愈多的證據(jù)表明，MAPK信號(hào)通路參與了PAH的肺血管重構(gòu)[13]。MAPK信號(hào)通路在血管平滑肌細(xì)胞的生長增殖中起著重要作用，抑制MAPK信號(hào)通路可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，并抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCT組大鼠肺小動(dòng)脈的MAPK信號(hào)通路(包括p38、ERK和JNK)磷酸化水平顯著增強(qiáng)，而黃芩素(50和100 mg/kg)明顯抑制MCT導(dǎo)致的MAPK信號(hào)通路的激活，提示黃芩素可能通過抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮其抗增殖作用，從而抑制肺動(dòng)脈重構(gòu)，改善PAH。

Figure 2. The degree of pulmonary arterial wall thickening in the rats of the 4 groups observed by HE staining (×400).

圖2HE染色觀察4組大鼠的肺血管壁增厚程度

表2各組大鼠WT%及WA%的比較

Table 2. Comparison of WT% and WA% in different groups (Mean±SD.n=5)

GroupWT%WA%Control18.82±1.0831.07±6.54MCT36.84±2.88**58.97±4.74**MCT+baicalein(50mg/kg)26.99±1.84##47.41±3.42#MCT+baicalein(100mg/kg)20.33±2.26##++37.67±3.35##+

**P<0.001vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMCT group;+P<0.05,++P<0.01vsMCT+baicalein (50 mg/kg) group.

總之，本研究探討了黃芩素對MCT誘導(dǎo)的PAH的作用，證實(shí)黃芩素可以通過抑制肺血管壁的增厚延緩PAH的發(fā)生發(fā)展，為黃芩素治療PAH的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 3. The protein levels of p-p38, p-ERK and p-JNK in the rats of the 4 groups determined by Western blot. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMCT group;+P<0.05,++P<0.01vsMCT+baicalein (50 mg/kg) group.

圖3Westernblot檢測4組大鼠的p38、ERK和JNK的磷酸化水平

[參 考 文 獻(xiàn)]

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