血管緊張素1-7通過Mas受體減輕血管緊張素II所致人腎小球內(nèi)皮細胞損傷*

張曉翠， 侯兆玉， 張紅利， 鄧 芳

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科， 安徽 合肥 230022)

血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的主要效應分子，在腎臟病理及生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]，其與Ang II 1型受體(Ang II type 1 receptor，AT1R)結合，可激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等多條細胞內(nèi)信號通路而發(fā)揮致炎作用，刺激細胞生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[2]。腎小球血管內(nèi)皮細胞(glomerular endothelial cells，GECs)與基底膜和足細胞共同組成腎小球濾過屏障，是腎臟發(fā)揮生理作用的基礎，亦是炎癥反應的靶細胞[3]。內(nèi)皮細胞損傷是血管病變的始動環(huán)節(jié)，GECs可表達多種血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素-1(endothelin-1， ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和所有RAS組分，而受損激活后可分泌多種炎癥因子如白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等。Ang II對GECs的損傷機制一直是研究者的關注重點。血管緊張素1-7(angiotensin 1-7, Ang1-7)是由Ang I和Ang II 轉化生成的七肽活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)腎臟功能上與Ang II相互拮抗[4]，已有研究證實Ang1-7可通過Mas受體拮抗Ang II誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，改善Ang II所致人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應[5-6]。而人腎小球內(nèi)皮細胞(human glomerular endothelial cells，HGECs)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞結構不同[7]，Ang1-7是否能夠通過Mas受體減輕Ang II所致?lián)p傷作用尚未確定，為此，本研究通過體外培養(yǎng)HGECs, 探討Ang1-7對Ang II所致HGECs損傷的作用及其可能機制，從而為臨床腎臟疾病的防治提供新的理論和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞與主要試劑

HGECs(廣州吉尼歐)。Ang II、Ang1-7和Mas受體抑制劑A779(TOCRIS)；DMEM低糖培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(BI)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；CCK-8試劑(上海貝博)；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(R&D)；ET-1、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β) ELISA試劑盒(Abcam)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和NO檢測試劑盒(南京建成)；MCP-1和ICAM-1 ELISA試劑盒(深圳達科為)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(BD)；ROS檢測試劑盒(碧云天)。

2 方法

2.1HGECs的體外培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)在含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的溫箱中常規(guī)培養(yǎng)和傳代。待細胞融合達80%后，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA適度消化、加完全培養(yǎng)基終止消化,用滅菌槍頭均勻輕柔吹落瓶壁細胞形成細胞懸液,1 000 r/min離心3 min，棄上清，按1∶3傳代。選擇生長良好的第3～5代對數(shù)生長期細胞用于實驗，所有細胞均于實驗前均換用無血清的DMEM培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)12 h。

2.2實驗分組 實驗主要分為6組：對照(control)組：不加干預因素；Ang II組：加入1 μmol/L Ang II培養(yǎng)； Ang II+ Ang1-7組：先用終濃度0.1 μmol/L的Ang1-7預處理30 min后，再加入終濃度為1 μmol/L Ang II共培養(yǎng)；Ang II+ Ang1-7+A779組：先用終濃度為10 μmol/L的A779預處理15 min后，再加入終濃度為0.1 μmol/L的Ang1-7，30 min后再加入終濃度為1 μmol/L的Ang II；Ang1-7組：加入0.1 μmol/L的Ang1-7處理；A779組：加入10 μmol/L的A779處理，所有組別均于最后一次給藥后連續(xù)培養(yǎng)24 h[6]。

2.3CCK-8實驗測定細胞活力并篩選藥物濃度與時間 調(diào)整HGECs密度為2×107/L，每孔100 μL接種于96孔板中，待細胞生長約70%左右加入Ang II使其終濃度分別為10、1、0.1、0.01和0.001 μmol/L(每組6個復孔),作用時間分別為12 h、24 h和36 h，然后每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h，使用酶標儀檢測各孔吸光度(A) 值，波長設定為450 nm，按公式計算細胞活力：細胞活力(%)=(加藥孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%，篩選藥物作用合適濃度與時間。在此基礎上依次加入Ang1-7(10、1、0.1和0.01 μmol/L)、A779(100、10和0.1 μmol/L)篩選合適濃度，實驗重復4次。

2.4流式細胞術Annexin V/PI雙標法檢測HGECs凋亡 將HGECs接種于12孔培養(yǎng)板中，當細胞貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素作用24 h后，用胰酶(不含EDTA)常規(guī)消化收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，輕棄上清液，加入預冷的PBS洗2次，再次離心后棄去上清液，動作輕柔，加入1×Buffer 200 μL調(diào)整密度為1×109/L細胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，實驗重復5次。

2.5細胞內(nèi)ROS含量的檢測 將HGECs接種于12孔培養(yǎng)板中，當細胞貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素作用24 h后，設置陽性對照組，陰性對照組及干預組，各組無血清培養(yǎng)基洗3次，避光下各實驗孔原位裝載1 μL的DCFH-DA探針，37 ℃孵育30 min后，棄去培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)基充分洗3次，于熒光顯微鏡(488/525 nm)拍攝各組ROS變化。常規(guī)消化收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，輕棄去部分上清液，按上述方法標記細胞，上流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的變化，實驗重復3次。

2.6HGECs培養(yǎng)液中各炎癥指標的檢測 各組細胞培養(yǎng)24 h后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定HGECs上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、ICAM-1和ET-1的含量，其中TGF-β需加入1 mol/L HCl和1.2 mol/L NaOH/0.5 mol/L HEPES混合液對樣本進行激活釋放TGF-β；利用微板法，按照LDH試劑盒說明書測定LDH的含量；應用硝酸還原酶法用酶標儀于550 nm處比色，按照NO試劑盒說明書操作，測定上清液中NO2-/NO3-含量，以間接反映其NO 水平。其中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1實驗重復6次，ET-1、NO和LDH實驗重復4次。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗進行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CCK-8法檢測細胞活力并篩選藥物的作用最適濃度與時間

利用CCK-8法檢測細胞活力，結果顯示選取1 μmol/L的Ang II作用HGECs 24 h作為最佳濃度及時間，見圖1。而Ang1-7及A779即在Ang II基礎上測定各濃度梯度細胞活力變化，以出現(xiàn)顯著差異濃度組為最佳，因而篩選Ang1-7為0.1 μmol/L，A779為10 μmol/L。

Figure 1. Concentration-time curve of HGECs viability induced by Ang II. Mean±SD.n=4.

圖1AngII在不同濃度和作用時間下細胞活力的變化

2 Ang 1-7與A779對Ang II所致HGECs凋亡的影響

流式細胞術檢測結果示,對照組HGECs的凋亡率較低；Ang II(1 μmol/L)處理HGECs 24 h后的細胞凋亡率與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；0.1 μmol/L Ang1-7的加入可減少Ang II誘導的細胞凋亡率(P<0.05)；而與Ang II+ Ang1-7組比較，10 μmol/L A779加入后增加了細胞凋亡率(P<0.05)；單獨Ang1-7和A779組細胞凋亡率與對照組對比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The effects of Ang1-7 and A779 on the apoptosis of HGECs induced by Ang II. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖2Ang1-7與A779對AngII所致人腎小球內(nèi)皮細胞凋亡的影響

3 Ang 1-7與A779對Ang II所致HGECs氧化應激的影響

Ang II(1 μmol/L)作用HGECs 24 h，胞內(nèi)ROS平均熒光強度增強，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而加入0.1 μmol/L Ang1-7可使胞內(nèi)ROS的生成減少，與Ang II組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ang II+ Ang1-7組比較，加入10 μmol/L A779 增加了胞內(nèi)ROS的生成(P<0.05)； 單獨Ang1-7和A779組與對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 3. The effects of Ang 1-7 and A779 on the production of ROS in HGECs induced by Ang II (×200). MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖3Ang1-7與A779對AngII所致人腎小球內(nèi)皮細胞ROS生成的影響

4 Ang 1-7與A779對Ang II誘導的HGECs培養(yǎng)上清中LDH、NO和ET-1含量的影響

與對照組相比，Ang II (1 μmol/L)組中HGECs LDH漏出明顯增加、ET-1分泌明顯增多，而NO的釋放減少(P<0.05)；與Ang II組相比，Ang1-7可呈劑量依賴性(0.01～10 μmol/L)地抑制Ang II所致的HGECs的LDH漏出和ET-1分泌，并促進NO的釋放(P<0.05)；與Ang II+Ang1-7組比較，加入A779可使Ang1-7的抑制作用減弱，LDH的漏出和ET-1的分泌增加，NO釋放減少(P<0.05)；單用Ang1-7(0.1 μmol/L)和A779(10 μmol/L)時LDH、ET-1和NO的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，結果見表1。

5 Ang1-7與A779對Ang II誘導的HGECs培養(yǎng)上清中 IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1含量的影響

與對照組相比，IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1在Ang II組分泌增多(P<0.05)；而與Ang II組比較，Ang II+Ang1-7組的IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1的含量明顯減少(P<0.05)；與Ang II+Ang1-7組比較，加入A779可使IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1含量增加(P<0.05)；單用Ang1-7和A779時的上述各指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4。

討 論

本研究旨在探討Ang1-7在Ang II誘導的HGECs損傷及氧化應激中的作用及可能機制，目前研究結果表明：(1)Ang II可使HGECs凋亡率增加、ROS生成增多、炎癥因子表達增多；(2)Ang1-7通過抑制Mas受體可降低Ang II所致的HGECs凋亡率、減少ROS生成和炎癥因子表達；(3)Ang1-7呈濃度依賴性抑制Ang II所致HGECs的損傷作用，其保護作用可被Ang1-7拮抗劑A779幾乎完全阻斷；(4)單獨應用Ang1-7和A779 對HGECs的上述指標無影響。

表1 細胞培養(yǎng)上清中LDH、NO和ET-1含量的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 (0.1 μmol/L) group.

Figure 4. The effects of Ang 1-7 and A779 on the concentrations of inflammatory mediators in HGECs induced by Ang II. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖4Ang1-7與A779對AngII誘導人腎小球內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)含量的影響

LDH和ET-1釋放水平增高，NO含量降低是內(nèi)皮細胞損傷及過度活化的標志。IL-6 升高可上調(diào)內(nèi)皮細胞表面ICAM-l的表達，促使中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞黏附于血管內(nèi)皮，造成血管內(nèi)皮細胞的損傷。MCP-1是一種單核細胞趨化蛋白，主要由內(nèi)皮細胞、單核細胞和平滑肌細胞表達，促進單核細胞攝取脂質(zhì)，演變成泡沫細胞。ICAM-1是一類介導細胞間或細胞與基質(zhì)黏附的分子，主要促進單核細胞與內(nèi)皮黏附、遷移和聚集等，是細胞激活后引起內(nèi)皮細胞損傷的關鍵。

Ang II 作為炎癥介質(zhì)，也可激活多種炎癥因子損傷GECs。Izawaishizawa 等[8]發(fā)現(xiàn)Ang II可上調(diào)TNF-α的活化劑ICAM-1在HGECs中的表達，引起炎癥反應、造成ROS大量堆積，損傷HGECs，使用AT1R阻斷劑可明顯減少TNF-α 造成的細胞毒性。梁斌等[4]研究發(fā)現(xiàn)Ang II在GECs內(nèi)激活RAS系統(tǒng)、活化還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的ROS和ET-1。Pan等[9]在小鼠腎小球內(nèi)皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang II在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴促進GECs的MCP-1表達，通過NADPH氧化酶依賴的ROS生成激活NF-κB通路。潘茜等[10]的實驗證實1 μmol/L的Ang II能激活p38絲裂原活化的蛋白激酶信號通路，上調(diào)某些促凋亡因子的表達促進GECs凋亡。Ang II增加TGF-β/Smad2/3、NF-κB信號通路的活化，促進促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、細胞增殖和細胞外基質(zhì)過度沉積，促進腎小球損傷[11]。因此，Ang II可通過激活炎癥反應、誘發(fā)氧化應激、誘導細胞凋亡、損傷腎小球血管內(nèi)皮結構和內(nèi)分泌功能等途徑損傷GECs。

Ang1-7可作為保護性短肽抑制Ang II誘導的MAPK信號通路活化[12]，還可減少膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1和血管內(nèi)皮生長因子等的表達[13]；Ang1-7通過刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，抑制磷酸肌醇激酶即PI3K/Akt/eNOS途徑，增加前列環(huán)素及NO釋放[14]，減少炎癥因子TNF-α等,矯正NF-κB早期轉錄翻譯水平。

綜上所述，Ang1-7通過Mas受體可抑制Ang II所誘導的HGECs的損傷、凋亡和氧化應激。

[參 考 文 獻]

[1] Urushihara M, Kagami S. Role of the intrarenal renin-angiotensin system in the progression of renal disease[J]. Pediatr Nephrol, 2017,32(9):1471-1479.

[2] Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2015, 308(4):F287-F297.

[3] Shoji K. Involvement of glomerular renin angiotensin system (RAS) activation in the development and progression of glomerular injury[J]. Clin Exp Nephrol, 2012, 16(2):214-220.

[4] 梁 斌， 楊志明， 張娜娜， 等. 血管緊張素(1-7)對血管緊張素II誘導的臍靜脈內(nèi)皮細胞MCP-1和ICAM-1表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(7):1319-1324.

[5] Yang HY, Bian YF, Zhang HP, et al. Angiotensin-(1-7) treatment ameliorates angiotensin II-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2012, 39(12):1004-1010.

[6] Murugan D, Lau YS, Chi WL, et al. Correction: angiotensin 1-7 protects against angiotensin II-induced endoplasmic reticulum stress and endothelial dysfunction via mas receptor[J]. PLoS One, 2015, 10(12):e0145413.

[7] Mcginn S, Poronnik P, Gallery ED, et al. A method for the isolation of glomerular and tubulointerstitial endothelial cells and a comparison of characteristics with the human umbilical vein endothelial cell model[J]. Nephrology, 2004, 9(4):229-237.

[8] Izawaishizawa Y, Ishizawa K, Sakurada T, et al. Angiotensin II receptor blocker improves tumor necrosis factor-α-induced cytotoxicity via antioxidative effect in human glomerular endothelial cells[J]. Pharmacology, 2012, 90(5-6):324-331.

[9] Pan Q, Yang XH, Cheng YX. Angiotensin II stimulates MCP-1 production in rat glomerular endothelial cells via NAD(P)H oxidase-dependent nuclear factor-kappa B signaling.[J]. Braz J Med Biol Res, 2009, 42(6):531-536.

[10] 潘 茜. 血管緊張素II對大鼠腎小球內(nèi)皮細胞炎性因子MCP-1表達和增殖、凋亡的影響及其AT_1受體拮抗劑替米沙坦作用的研究[D]. 沈陽：中國醫(yī)科大學, 2009.

[11] Meng XM, Tang PM, Li J, et al. TGF-β/Smad signaling in renal fibrosis[J]. 2015, 6:82.

[12] Gallagher PE, Ferrario CM, Tallant EA. MAP kinase/phosphatase pathway mediates the regulation of ACE2 by angiotensin peptides[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2008, 295(5):C1169-C1174.

[13] Zhang K, Meng X, Li D, et al. Angiotensin (1-7) attenuates the progression of streptozotocin-induced diabetic renal injury better than angiotensin receptor blockade[J]. Kidney Int, 2015,87(2):359-369.

[14] 陳健芳， 陳景福， 陳 巍， 等. 血管緊張素(1-7)通過抑制JAK/STAT信號通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3):481-488.