骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體用于大鼠脊髓損傷修復(fù)的初步探索*

王 琳， 裴 雙， 郭 斌， 路雁惠， 李燕飛， 段冉冉， 姚要兵， 陳雪梅， 賈延劼△

(鄭州大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 鄭州 450052)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重創(chuàng)傷，可造成脊髓神經(jīng)細(xì)胞死亡和膠質(zhì)瘢痕形成，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺及自主神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)痛等[1]，其損傷機(jī)制較為復(fù)雜，已知星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷中發(fā)揮重要作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[2-3]。脊髓損傷亞急性期過度活化的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子和神經(jīng)抑制因子，導(dǎo)致炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]，同時(shí)形成膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突再生[5-6]。SCI的治療至今仍是醫(yī)學(xué)界難題之一，近年來(lái)細(xì)胞移植在SCI治療的研究日益深入，顯示出良好的應(yīng)用前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有自我更新能力的多潛能干細(xì)胞，是目前比較理想的SCI細(xì)胞移植的供體細(xì)胞，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化具有較強(qiáng)的多靶點(diǎn)調(diào)控作用[7-10]。以往認(rèn)為其促修復(fù)機(jī)制在于歸巢并分化、代替損傷組織，近來(lái)認(rèn)為移植細(xì)胞分泌的胞外囊泡對(duì)于修復(fù)的作用可能更為重要[11]。外泌體(exosomes)是胞外囊泡的一種，直徑40～100 nm, 多種細(xì)胞均可分泌，通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸和脂類等調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。BMSCs來(lái)源的外泌體(BMSCs-exosomes)不僅能模擬 BMSCs 多數(shù)的生物學(xué)功能，而且與BMSCs相比，BMSCs外泌體體積小，不易堵塞微血管；無(wú)生長(zhǎng)增殖能力，誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)低；可靶向性穿過質(zhì)膜，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率高，在治療應(yīng)用上更具有優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)于外泌體在脊髓損傷中應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道尚較缺乏，本研究將外泌體移植作為脊髓損傷后的治療，觀察應(yīng)用外泌體后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能、損傷脊髓形態(tài)、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和殘余神經(jīng)元數(shù)量的變化，初步探索BMSCs-exosomes作為脊髓損傷的細(xì)胞替代療法的可行性。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

選取體重為 200～250 g 的成年健康雄性 SD 大鼠 110 只，SPF級(jí)別，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(豫)2015-0004。

DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；小鼠抗大鼠CD90抗體購(gòu)自BioLegend；小鼠抗大鼠CD34抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；PKH26染劑購(gòu)自Sigma；小鼠抗大鼠膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein，NeuN)單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗大鼠CD63抗體和小鼠抗大鼠CD9抗體購(gòu)自武漢三鷹公司；山羊抗小鼠Ⅱ抗、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自Jackson；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。IH-0400脊髓打擊器購(gòu)自Precision Systems & Instrumentation。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)術(shù)后取材時(shí)點(diǎn)不同將110只雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組：假手術(shù)(sham)組、脊髓損傷(injury)組(分別于1 d、3 d、7 d、14 d和28 d取材)及脊髓損傷+外泌體治療(treatment)組(分別于1 d、3 d、7 d、14 d和28 d取材)，每組10只。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs。乙醚麻醉大鼠并使用頸椎脫臼法將其處死，75%乙醇全身浸泡消毒10 min，無(wú)菌條件下剪取股骨和脛骨，無(wú)菌PBS(含有青霉素和鏈霉素)清洗3次并剔除骨骼附著組織，去除股骨和脛骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用低糖DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，并用吸管吹打均勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液重新懸浮沉淀的細(xì)胞，以1×109/L的細(xì)胞濃度接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的變化并更換培養(yǎng)基，此后每2～3 d換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)按照1∶2傳代培養(yǎng)。

2.3BMSCs表面標(biāo)志物的檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，用0.25% 胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS(含1% BSA)清洗細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后每個(gè)流式管內(nèi)加入1.0×109/L細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，于待測(cè)樣本中各加入100 μL PBS，并依次加入抗CD34和CD90單克隆抗體各1 μL，混勻后室溫避光孵育30 min，加PBS至總體積500 μL，充分混勻，上機(jī)檢測(cè)。

2.4BMSCs外泌體的提取及標(biāo)記 將胎牛血清經(jīng)100 000×g超速離心過夜以去除其中的外泌體，以含10%去除外泌體血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，傳至P4代，培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，收取培養(yǎng)基。培養(yǎng)基經(jīng)過300×g離心(4 ℃，10 min)，吸取上清，2 000×g離心(4 ℃，10 min)，取上清，10 000×g離心(4 ℃，30 min)，上清經(jīng)100 000×g離心(4 ℃，70 min)后，棄上清，所得沉淀即為外泌體。用1 mL Diluent C重懸外泌體，加入2 μL PKH26染液混勻后室溫孵育20 min，加入2 μL BSA終止標(biāo)記，1 min后加入適量PBS緩沖液，再次重復(fù)前述外泌體提取步驟。用100 μL的PBS緩沖液重懸，凍存于-80 ℃。

2.5BMSCs外泌體的鑒定 (1)普通熒光顯微鏡觀察外泌體：將PKH26標(biāo)記的外泌體PBS懸液滴加一滴于載玻片上，推片后熒光顯微鏡下觀察。(2)透射電鏡觀察外泌體：吸取20 μL外泌體懸液滴加于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上，濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干多余液體，在室溫下靜置2 min后，再向銅網(wǎng)上滴加3%磷鎢酸溶液10 μL，靜置5 min，透射電鏡下拍照。(3)Western blot測(cè)定外泌體標(biāo)志物表達(dá)：取超離得到的外泌體100 μL，加入5 μL含1%蛋白磷酸酶抑制劑和RIPA 細(xì)胞裂解液(碧云天)，冰上裂解 30 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。加入適量5×樣品緩沖液后，煮沸5 min。20 μL的樣品上樣行15% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉液封閉處理1 h。加入 I 抗(CD63和CD9單克隆抗體)，4 ℃搖床上過夜。經(jīng)TBST洗滌3次, 加入 II 抗 室溫下反應(yīng)2 h。再用TBST緩沖液洗滌3次后，應(yīng)用ECL法顯色, 在凝膠成像系統(tǒng)中掃描顯像。

2.6SCI模型的制備 4%異氟烷(0.6 L/min)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，2%異氟烷(1 L/min)進(jìn)行麻醉維持，切取背部正中切口，暴露T10棘突及椎板，手術(shù)鉗除去T10棘突及椎板，暴露T10脊髓后，假手術(shù)組直接進(jìn)行傷口逐層縫合，其它各手術(shù)組則使用IH-0400脊髓打擊器對(duì)T10節(jié)段進(jìn)行打擊，力度設(shè)定為2×105達(dá)因。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為損傷局部迅速充血水腫，雙后肢回縮樣撲動(dòng)、尾巴痙攣性擺動(dòng)。生理鹽水沖洗傷口，消毒縫合。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，術(shù)后 1 周內(nèi)每只小鼠每天給予慶大霉素2×103U腹腔注射，以防止感染發(fā)生。每天給予人工輔助排尿3次直至其自身的膀胱反射重新建立。

2.7尾靜脈注射外泌體 術(shù)后2 h，治療組通過尾靜脈注射200 μg/L的外泌體稀釋液100 μL，之后每隔2 d等量注射相同濃度的外泌體稀釋液。假手術(shù)組和損傷組于相同時(shí)點(diǎn)通過尾靜脈注射等量PBS。

2.8后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 于造模前及造模后 1 d、3 d、7 d、14 d和28 d 在灌注取材前對(duì)各組大鼠進(jìn)行BBB (Basso, Beattie and Bresnahan)評(píng)分，具體方法如下：將大鼠逐一置于平臺(tái)上, 2名不知分組情況的觀察者對(duì)每只大鼠仔細(xì)觀察 5 min并記錄其后肢運(yùn)動(dòng)功能，該大鼠的BBB評(píng)分為2名觀察者評(píng)分的均值，0分為完全癱瘓，21分為運(yùn)動(dòng)功能完全正常。

2.9灌注取材 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇不同時(shí)點(diǎn)將各組大鼠麻醉處死后，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定，取一段跨越損傷區(qū)長(zhǎng)約 1.5 cm 的脊髓，于甲醛固定液后固定過夜后，依次經(jīng)含20%和30%蔗糖的0.1 mol/L PBS中脫水沉糖至底后行連續(xù)冰凍切片(25 μm)，采用尼氏染色法觀察損傷脊髓的形態(tài)。

2.10免疫熒光觀察 尾靜脈注射外泌體的大鼠術(shù)后3 d其損傷脊髓制成的冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察到脊髓組織中PKH26陽(yáng)性外泌體的存在。用于免疫熒光的冰凍切片在0.01 mol/L PBS 中漂洗3次，每次10 min；用含 0.3% Triton 的山羊血清(5%)封閉 1 h； I 抗[GFAP抗體(1∶200)和NeuN抗體(1∶200)]，4 ℃孵育過夜；PBS 漂洗3 次，每次10 min; 加入 Alexa Fluor 488 熒光標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗(1∶200)，37 ℃孵育2 h； PBS 漂洗3次，每次10 min； DAPI (10 mg/L)3 min； PBS 漂洗 4次，每次 5 min；抗熒光淬滅劑封片。于顯微鏡下觀察拍照，Image-Pro Plus計(jì)數(shù)。每張切片在高倍鏡下分別隨機(jī)取5個(gè)視野行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均數(shù)作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后以每只大鼠3張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)代表該大鼠的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用雙因素方差分析對(duì)不同時(shí)點(diǎn)和不同處理組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 光鏡下BMSCs的形態(tài)觀察

第4代BMSCs在光鏡下呈均質(zhì)、漩渦狀,見圖1。

Figure 1. The BMSCs at the 4th passage under light microscope.

圖1光鏡下第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

2 BMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，BMSCs 的CD90陽(yáng)性率為97.4%， CD34陽(yáng)性率為0.091%,說(shuō)明BMSCs具有間充質(zhì)特異表型，不表達(dá)造血系表型,見圖2。

3 BMSCs外泌體的鑒定

超速離心法得到的沉淀，普通熒光顯微鏡下呈紅色點(diǎn)狀，見圖3；溶于PBS后通過透射電鏡觀察，可見外泌體呈直徑為40～100 nm的茶托狀囊泡結(jié)構(gòu),見圖4；Western blot法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63和CD9水平，結(jié)果顯示其陽(yáng)性表達(dá)CD63 和CD9，而對(duì)照組則無(wú)CD63和 CD9的表達(dá)，見圖5。

Figure 2. The surface markers CD90 and CD34 of BMSCs verified by flow cytometry.

圖2流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90和CD34

Figure 3. PKH26-labeled exosomes under fluorescence microscope (×200).

圖3熒光顯微鏡下PKH26標(biāo)記的外泌體

Figure 4. The exosomes under transmission electron microscope(×200 000).

圖4透射電鏡下外泌體的形態(tài)

4 PKH26標(biāo)記的外泌體通過血液循環(huán)到達(dá)脊髓

治療組損傷脊髓組織中觀察到均勻散在分布的PKH26陽(yáng)性點(diǎn)狀小體，對(duì)照組未觀察到，見圖6。

Figure 5. Western blot for determining CD63 and CD9 expression in the exosomes.

圖5CD63和CD9的Westernblot結(jié)果

Figure 6. PKH26-labeled exosomes in the lesion site of spinal cord (×200). A: the spinal cord with PKH26-labeled-exosome injection; B: the spinal cord without exosome injection.

圖6脊髓損傷處PKH26標(biāo)記的外泌體

5 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

BBB評(píng)分結(jié)果顯示，損傷組和外泌體治療組均有神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)，其中術(shù)后1 d、3 d和7 d評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著性，術(shù)后14 d和28 d治療組評(píng)分較損傷組升高(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. BBB scores of each group at different time points after SCI. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsinjury group.

圖7脊髓損傷后各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)的BBB評(píng)分

6 外泌體對(duì)SCI脊髓形態(tài)學(xué)的影響

尼氏染色結(jié)果顯示,損傷后14 d，與假手術(shù)組相比，損傷組脊髓背索存在較大的空洞，而外泌體治療組背索空洞明顯減小。假手術(shù)組脊髓前角尼氏體著色較深、排列規(guī)則；損傷組尼氏體著色淺淡、由正常網(wǎng)狀變?yōu)樯沉?，排列紊亂、發(fā)生溶解；外泌體治療組相比于損傷組，尼氏體排列較為規(guī)則，著色加深,見圖8。

Figure 8. Nissl staining of the spinal cord at 14 d after injury.

圖8脊髓損傷后外泌體對(duì)脊髓形態(tài)的影響

7 外泌體對(duì)SCI處反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

免疫熒光結(jié)果示，損傷組術(shù)后1 d 脊髓損傷區(qū)域反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加不明顯，3 d 后顯著增加，且呈持續(xù)增加趨勢(shì)，14 d后達(dá)高峰，28 d有所下降但仍高于正常水平。治療組術(shù)后1 d和3 d反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與損傷組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，術(shù)后7 d、14 d和28 d數(shù)量較損傷組明顯減少(P<0.05)，見圖9、10。

Figure 9. The immunofluorescence for GFAP (×200). A, D: sham group; B, C, G, H, I: injury group at 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after injury; E, F, J, K and L: treatment group at 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after injury.

圖9GFAP免疫熒光觀察結(jié)果

Figure 10. The number of reactive astrocytes in the injured site at different time points after injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsinjury group.

圖10脊髓損傷后不同時(shí)點(diǎn)損傷處反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的比較

8 外泌體對(duì)SCI后殘余神經(jīng)元數(shù)量的影響

免疫熒光結(jié)果示，治療組術(shù)后1 d和3 d殘余神經(jīng)元數(shù)量與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)損傷組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，術(shù)后7 d、14 d和28 d治療組殘余神經(jīng)元數(shù)量多于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)損傷組(P<0.05)，見圖11、12。

討 論

脊髓損傷后修復(fù)最大的障礙在于繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡和過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞阻礙神經(jīng)修復(fù)。雖然在損傷急性期(傷后2周內(nèi))，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過重建血-脊髓屏障、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[12]及調(diào)節(jié)損傷局部區(qū)域血流量[13]等對(duì)SCI修復(fù)起到一定程度的積極作用，但是在損傷亞急性期及恢復(fù)期(傷后2周以上)[14]，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕、阻礙軸突再生、分泌神經(jīng)抑制因子和炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、炎癥，對(duì)修復(fù)的不利作用更為顯著。近10年來(lái)，有關(guān)干細(xì)胞移植在實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷治療中應(yīng)用的研究日益深入，其中MSCs移植已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，顯示出良好的應(yīng)用前景。MSCs修復(fù)脊髓損傷的機(jī)制還不完全清楚，已知包括:分泌各種生物活性物質(zhì)促進(jìn)修復(fù);分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等代替死亡細(xì)胞;調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，改善損傷局部微環(huán)境。MSCs對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化具有較強(qiáng)的多靶點(diǎn)調(diào)控作用，能顯著減輕 SCI 的慢性炎癥和損傷，減少促炎因子和細(xì)胞毒性因子的釋放[7-8, 15]，從而減少炎癥引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化；調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞終足，影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A信號(hào)通路，穩(wěn)定血腦屏障[9]；下調(diào)瘢痕區(qū)域反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)蛋白聚糖(neurocan)蛋白表達(dá)，上調(diào)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43和突觸素蛋白表達(dá)[10, 16]。近來(lái)多數(shù)研究?jī)A向于認(rèn)為MSCs是通過自分泌和/或旁分泌各種因子，對(duì)修復(fù)起到促進(jìn)作用。2010年Lai等[11]分離了這些起修復(fù)作用的營(yíng)養(yǎng)因子，首次證實(shí)為 MSCs 外泌體。外泌體是直徑40～100 nm的胞外囊泡，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等多種生物活性物質(zhì)，功能上類似細(xì)胞信號(hào)儲(chǔ)存池，通過交換蛋白質(zhì)和基因信息的方式，促進(jìn)細(xì)胞間通訊[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體能減輕脊髓損傷后損傷局部的細(xì)胞凋亡、炎癥浸潤(rùn)[19]，但是相關(guān)研究較缺乏，具體機(jī)制尚未闡明。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷可引起GFAP表達(dá)增高[20]；NeuN是神經(jīng)元特異性核蛋白，可作為神經(jīng)元標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究大鼠BMSCs分泌的外泌體對(duì)SCI大鼠BBB評(píng)分、損傷脊髓形態(tài)學(xué)、GFAP和NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)影響，初步探索BMSCs外泌體作為脊髓損傷的細(xì)胞替代療法的可行性。對(duì)于損傷組，術(shù)后14 d～28 d 后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較為滯緩，而損傷區(qū)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的顯著增加主要集中于損傷后亞急性期，且在一段時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，損傷急性期局部神經(jīng)元大量死亡，恢復(fù)期殘存神經(jīng)元數(shù)量漸趨穩(wěn)定。外泌體治療組活化星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著少于損傷組主要發(fā)生于SCI后亞急性期、恢復(fù)期，并且在相近的時(shí)間段內(nèi)，治療組損傷處的殘存神經(jīng)元數(shù)量要多于損傷組，提示外泌體通過某種途徑對(duì)殘存神經(jīng)元起到了保護(hù)作用，并且體現(xiàn)在后肢運(yùn)動(dòng)功能相較損傷組有一定程度的改善。已有報(bào)道體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MSCs外泌體能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷、阿爾茨海默病等具有治療作用[21-24]，可能與抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)，但確切機(jī)制仍未闡明。推測(cè)外泌體有可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，抑制了活化星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性因子，從而對(duì)神經(jīng)元起到了保護(hù)作用，另一方面可能減少了膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)了軸突和髓鞘的再生,最終促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)功能一定程度的改善。目前外泌體已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性肺損傷、腦卒中、創(chuàng)傷修復(fù)、急慢性腎功能不全和心功能衰竭等[25-28]治療，在損傷的修復(fù)方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景，但其在脊髓損傷中的應(yīng)用尚較缺乏。本研究初步顯示了MSCs外泌體對(duì)于脊髓損傷后肢運(yùn)動(dòng)功能的改善具有一定促進(jìn)作用，由于應(yīng)用的是天然分泌的MSCs外泌體，限制了其治療效應(yīng)，若對(duì)其進(jìn)行人工修飾，如裝載抗炎、促修復(fù)藥物等治療效應(yīng)可能會(huì)有進(jìn)一步提高，后續(xù)會(huì)深入探究MSCs外泌體的治療效應(yīng)及潛在的分子機(jī)制.

Figure 11. The immunofluorescence for NeuN (×200). A, D: sham group; B, C, G, H, I: injury group at 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after injury; E, F, J, K, L: treatment group at 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after injury.

圖11NeuN免疫熒光觀察結(jié)果

Figure 12. The number of residual neurons on the injured site at different time points after injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsinjury group.

圖12脊髓損傷后不同時(shí)點(diǎn)損傷處殘余神經(jīng)元數(shù)量的比較

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