HSP22在高脂致動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用及對(duì)他汀干預(yù)的影響*

朱 敏， 吳延慶

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個(gè)慢性炎癥反應(yīng)過程。在這個(gè)過程中內(nèi)皮損傷起著關(guān)鍵作用。高脂是內(nèi)皮損傷的始動(dòng)因素，尤其是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)[1]。有研究表明，ox-LDL通過增加活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，加重細(xì)胞氧化損傷；同樣ox-LDL可促進(jìn)黏附分子及熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的表達(dá)，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和前列腺素的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子，如細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，故抗炎是治療AS的重要途徑之一[2-3]。

HSPs是一類生物體在各種應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白，其可使受損蛋白恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能并且抵御有害刺激，并促進(jìn)細(xì)胞存活和適應(yīng)外界環(huán)境，HSPs根據(jù)分子量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子熱休克蛋白家族(small heat shock proteins, sHSPs)及泛素[4]。有研究表明HSPs能夠影響AS的發(fā)生發(fā)展，如HSP27通過抑制組織氧化應(yīng)激，降低炎癥免疫反應(yīng)，從而抑制血管平滑肌的增殖、遷移及抗凋亡等效應(yīng)起到抗AS的作用[5]；而HSP60通過誘導(dǎo)抗HSP60適應(yīng)性免疫反應(yīng)加重內(nèi)皮功能紊亂，導(dǎo)致AS炎癥反應(yīng)[6]；HSP90則通過降低一氧化氮(nitric oxide，NO)的產(chǎn)生，從而減少eNOS和增加氧自由基的產(chǎn)生，加重了內(nèi)皮功能的紊亂[7]；HSP70在血管受應(yīng)激時(shí)保護(hù)血管免于受損，并通過促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10的表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[8]。但在某些情況下，HSP70又是有害因子，例如有研究表明高脂環(huán)境可以誘導(dǎo)HSP70表達(dá)升高，用外源性的HSP70孵育單核細(xì)胞可增加單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并大量釋放IL-6，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，進(jìn)一步加重AS的進(jìn)展[9]。

sHSPs是分子量12～43 kD的HSPs，均具有ATP激酶活性，其C端都有一段長約80～100個(gè)氨基酸的高度保守結(jié)構(gòu)域，稱為a晶體結(jié)構(gòu)域。熱休克蛋白22(heat shock protein 22，HSP22)是sHSPs家族成員之一，分子量為21.6 kD，又稱為HSPB8、E21G1、a晶狀體C和H11[10]。與其它sHSPs家族成員一樣具有分子伴侶和自身激酶等生物活性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移并抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)性作用。Marunouchi等[11]通過對(duì)心梗后心衰模型的研究發(fā)現(xiàn)，在心梗后心衰代償期心肌細(xì)胞HSP22的表達(dá)增加，并保護(hù)線粒體功能，而在失代償期，HSP22的減少與線粒體功能減退呈正相關(guān)，并加速了心衰的進(jìn)展，表明HSP22對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)性作用。我們團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷模型中，HSP22可通過抑制p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路的激酶，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)eNOS表達(dá)，說明HSP22具有抗氧化應(yīng)激及抗炎作用，延緩了AS的進(jìn)展[12]。同時(shí)我們也構(gòu)建了大鼠AS模型，發(fā)現(xiàn)HSP22及TNF-α在高脂血癥大鼠主動(dòng)脈的表達(dá)升高，而eNOS的表達(dá)下降，他汀干預(yù)可降低HSP22及TNF-α的表達(dá)[13]。

根據(jù)前期研究結(jié)果，我們推測HSP22在高脂致內(nèi)皮損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，而他汀的保護(hù)作用可能是通過對(duì)HSP22的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生。在本研究中，我們通過構(gòu)建HSP22基因缺失及過表達(dá)的ApoE-/-小鼠，并給予高脂飲食建立AS模型，探討HSP22基因在高脂致AS病變中的作用及對(duì)阿托伐他汀(atorvastatin，Ator)干預(yù)的影響。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和主要試劑

8～9周齡、體重20～24 g的SPF級(jí)ApoE-/-、HSP22-/-ApoE-/-和HSP22+ApoE-/-雄性小鼠各18只，其中ApoE-/-雄性小鼠購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司(合格證編號(hào)為2014-0007)，HSP22-/-ApoE-/-及HSP22+ApoE-/-雄性小鼠購于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司(合格證編號(hào)為11806300000247)。動(dòng)物飼養(yǎng)于南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，配有S8智能型獨(dú)立通氣籠IVC系統(tǒng)，籠具及飲用水均滅菌消毒處理，光照及黑暗時(shí)間各12 h，溫度21 ℃，濕度77.5%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和處理程序經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查通過，審批號(hào)為研臨審【2012】第(002)號(hào)。普通飼料為小鼠繁殖飼料(SPF級(jí))，高脂飼料為乳脂動(dòng)脈粥樣硬化飼料(主要成分為蛋白質(zhì)20%、碳水化合物 50%、脫水乳脂21%和膽固醇 0.15%)，購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；阿托伐他汀鈣片購于輝瑞制藥有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立 3種小鼠適應(yīng)性基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周后，稱重，每種小鼠按體重由小到大排序，隨后采用隨機(jī)數(shù)字表分別將3種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(control)組與Ator干預(yù)組(Ator)組，HSP22基因缺失(HSP22 knockout，KO)組與HSP22基因缺失Ator干預(yù)(KO+Ator)組及HSP22過表達(dá)(HSP22 overexpression，Tg)組與HSP22過表達(dá)Atro干預(yù)(Tg+Ator)組，均高脂飲食12周，其中Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組從第5周開始給予Ator (10 mg·kg-1·d-1)干預(yù)，所有對(duì)照組給予等量生理鹽水干預(yù)，共飼養(yǎng)13周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。

2.2取材 在禁食不禁飲12 h 后，10%水合氯醛0.05～0.07 mL腹腔麻醉，眼內(nèi)眥靜脈采血法采集適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后及干預(yù)結(jié)束后小鼠的空腹血，離心取血清。干預(yù)結(jié)束取血后，迅速剪開胸腹腔，用預(yù)冷的PBS沖洗并分離出心臟及整個(gè)主動(dòng)脈。每組取6只小鼠的主動(dòng)脈根部(包括主動(dòng)脈瓣環(huán)、主動(dòng)脈瓣尖和主動(dòng)脈竇)血管用于HE染色，每組取6只小鼠的主動(dòng)脈弓(頭臂干起始部至主動(dòng)脈峽部)用于免疫組化，每組取3只小鼠整個(gè)主動(dòng)脈(頭臂干起始部至髂總動(dòng)脈分叉處整條動(dòng)脈)用于整體油紅O染色。其余血管組織用于蛋白定量分析。

2.3血清學(xué)指標(biāo)的檢測 根據(jù)試劑盒說明書測定干預(yù)前及干預(yù)結(jié)束后血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C)，其中TC和TG檢測采用酶法分析，LDL-C和HDL-C采用選擇性沉淀法測定(BioSino)。同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測血清中HSP22和IL-6的水平(RayBiotech)。

2.4主動(dòng)脈斑塊的形態(tài)學(xué)觀察 將主動(dòng)脈根部進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，取經(jīng)主動(dòng)脈瓣膜處動(dòng)脈組織進(jìn)行HE染色，經(jīng)脫蠟、水化、染色、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡拍照。清除整個(gè)主動(dòng)脈外膜脂肪組織，4%多聚甲醛固定過夜，PBS沖洗1 d 后，異丙醇脫水?dāng)?shù)分鐘，室溫下經(jīng)油紅O染色4 h(避光)，將動(dòng)脈取出后在85%異丙醇中沖洗4次，每次5min，PBS沖洗干凈并將動(dòng)脈伸展開，行數(shù)碼拍照。

2.5Western blot法檢測HSP22、eNOS、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及ICAM-1的蛋白表達(dá) 取出動(dòng)脈組織置于冰上，稱重，加入液氮研磨，在研磨好的組織中加入裂解液(1 mL RIPA裂解液+10 μL PMSF+10 μL的磷酸酶抑制劑)，裂解60 min后離心取上清得到樣品，并用BCA法測定蛋白濃度。蛋白在SDS-PAGE中分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，結(jié)合Ⅰ抗(HSP22，1∶500，Abcam；eNOS，1∶500，Abcam；NF-κB，1∶1 000，Affinity Biosciences Company；ICAM-1，1∶1 000， Cell Signaling Technology； GAPDH，1∶1 000，中杉金橋生物技術(shù)公司)， 4 ℃過夜； TBST漂洗3次； Ⅱ抗(兔抗、鼠抗均為1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗3次；加ECL發(fā)光液顯色，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

2.6免疫組化法檢測主動(dòng)脈中HSP22和NF-κB的表達(dá)水平 主動(dòng)脈弓血管組織切片脫蠟后，置于PBS中，經(jīng)抗原修復(fù)液高溫修復(fù)，Tris-HCl緩沖鹽溶液清洗2次，3%過氧化氫溶液室溫10 min，清除內(nèi)源性過氧化物酶，Tris-HCl緩沖鹽溶液清洗3次，血清封閉液封閉1 h，滴加HSP22單克隆抗體(1∶100)和NF-κB多克隆抗體(1∶50)4 ℃過夜，添加Ⅱ抗1 h，DAB 染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，方差分析后各組均數(shù)間的兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

圖1A為ApoE基因缺失小鼠鑒定結(jié)果，僅在245 bp處出現(xiàn)透亮條帶者為ApoE-/-小鼠；圖1B為HSP22基因缺失小鼠鑒定結(jié)果，僅在175 bp處出現(xiàn)透亮條帶者為HSP22-/-小鼠，在371 bp及175 bp均出現(xiàn)條帶者為HSP22+/-，僅在371 bp處出現(xiàn)條帶者為HSP22野生型小鼠；圖1C為HSP22過表達(dá)小鼠鑒定結(jié)果，在241 bp處出現(xiàn)透亮條帶者為HSP22+小鼠。后續(xù)實(shí)驗(yàn)挑選基因型符合的小鼠。

Figure 1. The genotyping results ofApoE-/-mice (A),HSP22-/-mice (B) andHSP22+mice (C) identified by PCR.

圖13種小鼠的PCR基因型鑒定結(jié)果

2 小鼠體重的變化

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠按體重分層隨機(jī)分組，各組間基線體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在高脂飲食4周后(干預(yù)前)，各組間小鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。各組小鼠繼續(xù)喂食高脂飼料8周，其中Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組從第5周開始給予Ator干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，Ator組小鼠體重低于對(duì)照組(P<0.05)，Tg+Ator組低于Tg組(P<0.05)；其中Tg+Ator組及Ator組小鼠體重均低于KO+Ator組(P<0.05)，對(duì)照組及KO組均高于Tg組(P<0.05)，Ator組與Tg+Ator組及對(duì)照組與KO組體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

3 血脂水平的變化

3.1基線血脂 適應(yīng)性喂食1周后，各組間基線血脂水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

3.2干預(yù)結(jié)束時(shí)血脂的變化 經(jīng)高脂飼料飲食12周后，Tg組血清LDL-C及TC較KO組降低(P<0.05)，對(duì)照組、KO組與Tg組小鼠血清中TG和HDL-C的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。給予Ator干預(yù)8周后，Ator組血清TC及LDL-C低于對(duì)照組(P<0.05)，HDL-C高于對(duì)照組(P<0.05)；KO+Ator組的血清TC及LDL-C較KO組明顯降低(P<0.05)，HDL-C高于KO組(P<0.05)；Tg+Ator組血清TC及LDL-C較Tg組明顯降低(P<0.05)，HDL-C高于Tg組(P<0.05)；其中Tg+Ator組血清中LDL-C和HDL水平與Ator組及KO+Ator組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。各組小鼠血清中TG變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 2. The body weight of the mice before and after treatment with high-fat diet (HFD) and atorvastatin (Ator). Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖2各組小鼠基線、干預(yù)前及干預(yù)后體重的變化

4 病理形態(tài)學(xué)的變化

4.1主動(dòng)脈整體油紅O染色 干預(yù)結(jié)束后，行主動(dòng)脈整體油紅O染色，結(jié)果顯示對(duì)照組、KO組及Tg組紅染脂質(zhì)斑塊相對(duì)較多，在主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈及發(fā)出頸動(dòng)脈處有多處斑塊；而Ator干預(yù)8周后斑塊面積較單純高脂飲食減少，見圖4A。比較小鼠主動(dòng)脈整體油紅O染色的斑塊相對(duì)面積(斑塊總面積/血管總面積)，結(jié)果顯示，Ator組較對(duì)照組減少(P<0.05)，KO+Ator組較KO組減少(P<0.05)，Tg+Ator組較Tg組減少(P<0.05)，見圖4B。

表1血脂基線水平的檢測結(jié)果

Table 1. Blood lipid levels of the mice before treatment with high-fat diet (mmol/L. Mean±SD.n=9).

GroupTCTGLDL-CHDL-CControl5.66±0.610.97±0.182.82±0.080.58±0.08Ator5.74±0.600.97±0.162.87±0.110.58±0.07KO5.52±0.520.98±0.592.90±0.110.57±0.02KO+Ator5.59±0.710.97±0.102.89±0.120.57±0.05Tg5.96±0.540.97±0.072.86±0.120.57±0.03Tg+Ator5.81±0.530.98±0.072.98±0.140.58±0.03

Figure 3. The blood lipid levels of the mice after treatment with high-fat diet and atorvastatin (Ator). Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖3各組小鼠干預(yù)結(jié)束時(shí)血脂水平的比較

Figure 4. The total preparation of the mouse aorta with oil red O staining (A) and the quantitative analysis for detecting the relative area of aortic plaque (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsKO group;$P<0.05vsTg group.

圖4主動(dòng)脈整體油紅O染色和主動(dòng)脈斑塊相對(duì)面積的定量分析

4.2主動(dòng)脈弓HE染色 干預(yù)結(jié)束后小鼠主動(dòng)脈弓行HE染色結(jié)果可見，對(duì)照組、KO組及Tg組鏡下見粥樣斑塊形成，斑塊表面為厚薄不均勻的纖維帽，纖維帽下含有泡沫細(xì)胞、針狀空隙的膽固醇結(jié)晶及大量壞死產(chǎn)物，斑塊下內(nèi)彈性膜破壞，可見SMC穿過內(nèi)彈力膜，中膜SMC及纖維層排列紊亂；其中Tg組粥樣斑塊較對(duì)照組及KO組減少。經(jīng)Ator干預(yù)8周后，Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組鏡下見向管腔凸起的斑塊形成，斑塊表面為纖維帽，纖維帽下見大量泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，未見明顯膽固醇空隙和鈣鹽沉積，斑塊下內(nèi)彈性膜尚完整，中膜可見排列尚整齊的梭形平滑肌細(xì)胞，纖維層結(jié)構(gòu)尚完整；其中可見Tg+Ator組粥樣斑塊較Ator組及KO+Ator組減少，見圖5。

4.3主動(dòng)脈根部HE染色 干預(yù)結(jié)束后，對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部(經(jīng)瓣膜處)行HE染色，各組均可見斑塊形成，但斑塊形態(tài)及相對(duì)面積不一。對(duì)照組、KO組及Tg組斑塊形成多，斑塊內(nèi)見大量膽固醇結(jié)晶、泡沫細(xì)胞、壞死產(chǎn)物及炎癥細(xì)胞；Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組主動(dòng)脈竇部可見大量斑塊形成，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，見少量膽固醇結(jié)晶，見圖6A。主動(dòng)脈根部斑塊相對(duì)面積結(jié)果示，Tg組斑塊面積少于KO組和對(duì)照組(P<0.05)，KO組斑塊面積多于對(duì)照組(P<0.05)；經(jīng)Ator干預(yù)8周后，主動(dòng)脈根部斑塊相對(duì)面積示Tg+Ator組少于Tg組(P<0.05)，KO+Ator組少于KO組(P<0.05)，Ator組少于對(duì)照組(P<0.05)，見圖6B。

Figure 5. Observation of the aortic arch with HE staining.

圖5主動(dòng)脈弓的HE染色觀察

Figure 6. The observation of aortic root with HE staining (A) and the quantitative analysis for detecting the relative area of mouse aortic root plaque (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsKO group;$P<0.05vsTg group.

圖6主動(dòng)脈根部HE染色觀察和主動(dòng)脈根部斑塊相對(duì)面積的定量分析

5 HSP22、NF-κB、eNOS、ICAM-1及IL-6的檢測

5.1主動(dòng)脈HSP22蛋白表達(dá)的變化 Western blot法檢測小鼠主動(dòng)脈HSP22蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示Tg組的HSP22蛋白表達(dá)高于KO組及對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組高于KO組(P<0.05)。經(jīng)Ator干預(yù)8周之后，主動(dòng)脈HSP22表達(dá)在KO組與KO+Ator組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；Ator組低于對(duì)照組(P<0.05)，Tg+Ator組低于Tg組(P<0.05)；其中Tg+Ator組高于Ator組及KO+Ator組(P<0.05)，見圖7。免疫組化法檢測小鼠主動(dòng)脈的HSP22蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示Tg組及對(duì)照組可見陽性著色多，與KO組及Ator組相比HSP22蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；其中對(duì)照組高于KO組(P<0.05)；經(jīng)Ator干預(yù)8周之后，Tg+Ator組較Tg組陽性著色淺(P<0.05)，Ator組較對(duì)照組陽性著色淺(P<0.05)，KO+Ator組與KO組陽性著色無明顯變化；其中Tg+Ator組較Ator組及KO+Ator組陽性著色深，表示HSP22表達(dá)較Ator組及KO+Ator組多(P<0.05)，見圖7B。

Figure 7. The protein expression of HSP22 in the aorta determined by Western blot (A) and immunohistochemistry (B, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖7Westernblot法和免疫組化法檢測主動(dòng)脈HSP22蛋白的表達(dá)

5.2主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)的變化 Western blot法檢測小鼠主動(dòng)脈NF-κB蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示小鼠主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)在對(duì)照組中較KO組降低(P<0.05)、較Tg組升高(P<0.05)；經(jīng)Ator干預(yù)8周后，主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)示Ator組較對(duì)照組降低(P<0.05)，KO+Ator組較KO組降低(P<0.05)，Tg+Ator組較Tg組降低(P<0.05)；其中KO+Ator組較Ator組及Tg+Ator組升高(P<0.05)，而Ator組與Tg+Ator組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖8A。免疫組化法檢測小鼠主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)，結(jié)果可見對(duì)照組、KO組及Tg組小鼠主動(dòng)脈棕色著色深，其中，KO組棕色著色深于對(duì)照組及Tg組，表示NF-κB蛋白表達(dá)高于Tg組(P<0.05)，其中Tg組低于對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)Ator干預(yù)8周后，Ator組較對(duì)照組棕色著色淺(P<0.05)，KO+Ator組較KO組棕色著色淺(P<0.05)，Tg+Ator組較Tg組棕色著色淺(P<0.05)；而Ator組、KO組與Tg+Ator之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖8B。

5.3主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的變化 Western blot法檢測小鼠主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，Tg組及對(duì)照組較KO組升高(P<0.05)。經(jīng)Ator干預(yù)8周后，小鼠主動(dòng)脈eNOS蛋白的表達(dá)Ator組較對(duì)照組升高(P<0.05)，KO+Ator組較KO組升高(P<0.05)，Tg+Ator組較Tg組升高(P<0.05)；其中KO+Ator組較Ator組及Tg+Ator組下降(P<0.05)，見圖9。

Figure 8. The protein expression of NF-κB in the aorta determined by Western blot (A) and immunohistochemistry (B, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖8Westernblot法和免疫組化法檢測主動(dòng)脈NF-κB蛋白的表達(dá)

5.4主動(dòng)脈ICAM-1蛋白表達(dá)的變化 Western blot法檢測小鼠主動(dòng)脈ICAM-1蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，KO組高于對(duì)照組及Tg組(P<0.05)，其中Tg組低于對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)Ator干預(yù)8周后，小鼠主動(dòng)脈ICAM-1蛋白的表達(dá)示Ator組低于對(duì)照組(P<0.05)，KO+Ator組較KO組降低(P<0.05)，Tg+Ator組較Tg組降低(P<0.05)；其中KO+Ator組較Ator組及Tg+Ator組升高(P<0.05)，Tg+Ator組較Ator組降低(P<0.05),見圖10。

5.5血清IL-6濃度的變化 ELISA檢測小鼠血清IL-6的濃度，結(jié)果顯示對(duì)照組、KO組及Tg組小鼠血清IL-6水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在Ator干預(yù)8周之后，血清中IL-6濃度在Ator組低于對(duì)照組(P<0.05)，KO+Ator組低于KO組(P<0.05), Tg+Ator組低于Tg組(P<0.05)；而血清IL-6水平在Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖11A。

5.6血清HSP22濃度的變化 ELISA檢測小鼠血清HSP22的濃度，結(jié)果顯示KO組低于對(duì)照組和Tg組(P<0.05)，對(duì)照組低于Tg組(P<0.05)。經(jīng)Ator干預(yù)8周后，小鼠血清HSP22濃度在Ator組低于對(duì)照組(P<0.05)，KO+Ator組與KO組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Tg+Ator組低于Tg組(P<0.05)，KO+Ator組低于Ator組及Tg+Ator組(P<0.05)，Tg+Ator組高于Ator組(P<0.05)，見圖11B。

討 論

1 動(dòng)脈粥樣硬化

AS的危險(xiǎn)因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖、吸煙、血管炎癥及血栓形成等。這些因素的存在會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的活性氧簇的產(chǎn)生，炎癥因子表達(dá)增加，其中尤其是脂質(zhì)的異常，機(jī)體ROS會(huì)將LDL氧化為ox-LDL，而ox-LDL會(huì)促使內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加，激活單核細(xì)胞遷移到血管壁，上調(diào)黏附分子及炎癥因子的表達(dá)，而遷移到血管壁的單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，ox-LDL被巨噬細(xì)胞所攝取形成泡沫細(xì)胞，沉積在受損的內(nèi)皮細(xì)胞表面[14]。這些變化進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)，加速AS的進(jìn)展，因此抗炎、抗氧化應(yīng)激是治療AS的重要途徑。

Figure 9. The protein expression of eNOS in the aorta determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖9Westernblot法檢測主動(dòng)脈eNOS蛋白的表達(dá)

Figure 10. The protein expression of ICAM-1 in the aorta determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖10Westernblot法檢測主動(dòng)脈ICAM-1蛋白的表達(dá)

Figure 11. The concentrations of serum IL-6 (A) and HSP22 (B) were measured by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAtor group;△P<0.05vsKO group;▲P<0.05vsKO+Ator group;$P<0.05vsTg group.

圖11ELISA檢測血清IL-6和HSP22的濃度

我們前期研究已經(jīng)成功構(gòu)建小鼠AS模型，將此方法應(yīng)用于本研究中[15]，通過對(duì)所有小鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)12周構(gòu)建AS模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和KO組小鼠體重、血脂及炎癥因子IL-6、ICAM-1和NF-κB的水平分別明顯高于Ator組及KO+Ator組，主動(dòng)脈根部及弓部肉眼和體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)斑塊較多，鏡下見斑塊內(nèi)大量泡沫細(xì)胞形成，血管平滑肌細(xì)胞向管壁內(nèi)膜遷移，斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶形成，由此說明，本研究成功構(gòu)建了小鼠AS模型。

在本研究中，各組小鼠基礎(chǔ)體重及血脂水平無明顯差異，在高脂飲食12周后，小鼠血清中TG及HDL-C的含量在對(duì)照組、KO組及Tg組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Tg組血清的LDL-C及TC較KO組顯著降低，說明HSP22可直接降低LDL-C水平，其作用可能是通過降低炎癥反應(yīng)來發(fā)揮的，具體機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。他汀干預(yù)8周后，Ator組的血清TC及LDL-C低于對(duì)照組、HDL-C高于對(duì)照組，KO+Ator組血清TC及LDL-C低于KO組、HDL-C高于KO組，Tg+Ator組血清TC及LDL-C低于Tg組、HDL-C高于Tg組；Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組血清LDL-C及HDL-C間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，由此說明他汀的調(diào)脂作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于HSP22；各組小鼠血清中的TG在干預(yù)前后無顯著變化，說明他汀及HSP22對(duì)TG無明顯影響。就小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積而言，Tg組主動(dòng)脈斑塊相對(duì)面積低于KO組，說明HSP22過表達(dá)可改善AS的進(jìn)展，他汀干預(yù)8周后，主動(dòng)脈斑塊面積于Ator組低于對(duì)照組，KO+Ator組低于KO組，Tg+Ator組低于Tg組；其中Tg+Ator組主動(dòng)脈斑塊面積較KO+Ator組減少，說明HSP22可促進(jìn)他汀進(jìn)一步改善AS。綜合以上結(jié)果，說明HSP22基因缺失及過表達(dá)會(huì)影響AS進(jìn)展，HSP22基因缺失會(huì)加重AS進(jìn)展，過表達(dá)可發(fā)揮抗AS作用，他汀具有顯著抗AS作用，HSP22與他汀具有協(xié)同作用，可促進(jìn)他汀調(diào)脂及改善AS作用。

2 HSP22在AS中的表達(dá)及作用

在缺氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體內(nèi)HSP22能上調(diào)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表達(dá)，增加NO產(chǎn)生，調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能，減少氧化磷酸化及ROS的產(chǎn)生及線粒體轉(zhuǎn)換孔的開放，起到保護(hù)心肌細(xì)胞效應(yīng)[16]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥致大鼠AS模型中，主動(dòng)脈HSP22蛋白表達(dá)顯著升高，他汀治療后可降低HSP22蛋白的表達(dá)，緩解AS進(jìn)展[13]。用ox-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可引起HSP22蛋白表達(dá)升高，而干擾HSP22表達(dá)時(shí)會(huì)加重ox-LDL所致的細(xì)胞凋亡，表明HSP22可改善ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[12]。

本研究用Western blot和免疫組化法檢測小鼠主動(dòng)脈的HSP22表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KO組及KO+Ator組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Tg組高于KO組及對(duì)照組，對(duì)照組高于KO組，這與主動(dòng)脈斑塊面積、炎癥因子表達(dá)的變化一致，由此說明長期高脂飲食誘導(dǎo)AS，在此內(nèi)皮損傷刺激下，HSP22應(yīng)激性表達(dá)升高，從而對(duì)血管損傷產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，而HSP22過表達(dá)在AS發(fā)生發(fā)展中起到抵抗應(yīng)激的作用，從而改善AS。HSP22可定位于細(xì)胞內(nèi)，也可旁分泌到細(xì)胞外，前期研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥小鼠較對(duì)照組，血清HSP22的濃度顯著增加，考慮是因?yàn)殚L期慢性炎癥刺激導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激性反應(yīng)使HSP22的表達(dá)上調(diào)，并可向細(xì)胞外分泌(如血液)。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中HSP22濃度在KO組及KO+Ator組未見明顯差異，Tg組高于KO組及對(duì)照組，對(duì)照組高于KO組，這與主動(dòng)脈HSP22蛋白表達(dá)情況一致，由此說明胞內(nèi)外HSP22水平變化是一致的。這是一個(gè)觀察性研究，未深入探討胞外(如血清)HSP22濃度增加的機(jī)制。胞外HSP22是否具有胞內(nèi)HSP22的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用，目前尚未有研究報(bào)道。

3 HSP22對(duì)阿托伐他汀干預(yù)的影響

他汀類藥物如阿托伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑，除了具有調(diào)脂作用外，還有改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定斑塊及抑制血栓形成等作用。他汀的降脂治療是基于降低LDL水平，且部分是通過升高HSP90表達(dá)從而上調(diào)eNOS并可穩(wěn)定eNOS的mRNA表達(dá)而起作用的[17]。

前期研究結(jié)果顯示用他汀治療AS模型大鼠，可降低HSP22蛋白的表達(dá)，緩解AS進(jìn)展。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在他汀干預(yù)8周之后，KO組與KO+Ator組主動(dòng)脈及胞外血清中HSP22無顯著差異，而Ator組及Tg+Ator組主動(dòng)脈及胞外血清中HSP22表達(dá)較相應(yīng)對(duì)照組顯著降低，與主動(dòng)脈斑塊面積、炎癥因子IL-6、ICAM-1、NF-κB以及血脂的變化相一致，并與前期研究結(jié)果一致。由此說明他汀可降低HSP22表達(dá)，提示他汀未能通過上調(diào)HSP22的表達(dá)來改善AS進(jìn)展。主動(dòng)脈及血清中HSP22蛋白表達(dá)在Tg+Ator組中高于Ator組及KO+Ator組。而斑塊面積及炎癥因子則相反，由此推測，HSP22過表達(dá)與他汀具有協(xié)同作用，可進(jìn)一步放大他汀的抗炎及調(diào)脂效應(yīng)，進(jìn)一步改善AS，而AS改善后，應(yīng)激刺激減少，主動(dòng)脈及血清中HSP22表達(dá)反饋性下降。

4 eNOS與HSP22的關(guān)系及他汀干預(yù)的影響

內(nèi)皮損傷是AS病變的起始因素，內(nèi)皮功能在很大程度上依賴eNOS的表達(dá)，由eNOS合成的NO能抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)、細(xì)胞遷移、增殖，并調(diào)節(jié)血管張力及血小板激活等，高脂血癥可致細(xì)胞eNOS合成的NO減少，NO的生物利用度降低[18]。eNOS催化L-精氨酸和分子氧生成L-瓜氨酸和NO，NO不僅是一種血管舒張因子，還具有調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的遷移、白細(xì)胞的黏附及抗血小板聚集的作用，影響著心血管系統(tǒng)疾病的生理病理過程[19]。在本團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)，高脂飲食致大鼠AS模型中主動(dòng)脈HSP22表達(dá)水平升高，eNOS水平下降，他汀治療后可降低主動(dòng)脈HSP22蛋白的表達(dá)，升高eNOS水平，緩解AS進(jìn)展[13]，在細(xì)胞層面上，HSP22作用于HUVECs，發(fā)現(xiàn)eNOS和p-eNOS上調(diào)，促進(jìn)了NO的釋放，內(nèi)皮細(xì)胞功能得到改善[12]。

在本研究中，所有小鼠經(jīng)12周高脂飲食后，主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)在Tg組和對(duì)照組高于KO組，說明在高脂應(yīng)激下HSP22可上調(diào)eNOS表達(dá)。他汀治療8周后，主動(dòng)脈的eNOS蛋白表達(dá)在Ator組較對(duì)照組升高，KO+Ator組較KO組升高，Tg+Ator組較Tg組升高，說明他汀干預(yù)可上調(diào)eNOS表達(dá)；其中KO+Ator組eNOS的蛋白表達(dá)較Ator組及Tg+Ator組下降。由此可見HSP22基因缺失部分限制了他汀上調(diào)eNOS表達(dá)的作用，但過表達(dá)并沒有促進(jìn)他汀上調(diào)eNOS表達(dá)。他汀對(duì)eNOS的調(diào)控作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于HSP22，兩者可能是通過不同信號(hào)通路對(duì)eNOS表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

5 NF-κB與HSP22的關(guān)系及他汀干預(yù)的影響

HSP90可以抑制NF-κB的產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，從而降低糖尿病小鼠糖尿病腎病及心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生率[20]。在本研究中，經(jīng)12周高脂飲食后，小鼠主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)在對(duì)照組低于KO組、高于Tg組，由此說明HSP22參與了NF-κB表達(dá)的調(diào)控，過表達(dá)HSP22可抑制NF-κB的激活；他汀治療8周之后，主動(dòng)脈NF-κB蛋白表達(dá)在Ator組較對(duì)照組降低，KO+Ator組較KO組降低，Tg+Ator組較Tg組降低；其中KO+Ator組較Ator組及Tg+Ator組升高；說明他汀干預(yù)可降低NF-κB表達(dá)，HSP22基因缺失部分限制了他汀下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用，但過表達(dá)并沒有促進(jìn)他汀下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用，且他汀對(duì)NF-κB表達(dá)的調(diào)控作用遠(yuǎn)強(qiáng)于HSP22，兩者可能是通過不同的信號(hào)通路對(duì)NF-κB 進(jìn)行調(diào)控。

6 ICAM-1與HSP22的關(guān)系及他汀干預(yù)的影響

膽固醇作用于人內(nèi)皮細(xì)胞可通過鹽皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)ICAM-1的轉(zhuǎn)錄水平。對(duì)ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)膽固醇4周后，ICAM-1表達(dá)升高，這與主動(dòng)脈根部斑塊面積、脂質(zhì)水平及炎癥因子增加是一致的；在ICAM-1與ApoE雙敲除(ApoE-/-/ICAM-1-/-)小鼠AS模型中，斑塊面積、脂質(zhì)水平及巨噬細(xì)胞滲透性下降了[21]。在應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體中的HSP60會(huì)遷移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并協(xié)同黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1)大量表達(dá)于細(xì)胞表面，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，另外，在感染、機(jī)械應(yīng)激等內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變時(shí)，HSP60本身也會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生VCAM-1、ICAM-1及IL-6的表達(dá)，這些分子的存在加速了AS的進(jìn)展[22]。

在本研究中，高脂飲食12周后，小鼠主動(dòng)脈ICAM-1蛋白表達(dá)在KO組高于對(duì)照組及Tg組，其中Tg組低于對(duì)照組，由此說明HSP22可降低ICAM-1的表達(dá)；經(jīng)Ator干預(yù)8周后，小鼠主動(dòng)脈ICAM-1蛋白表達(dá)在Ator組低于對(duì)照組，KO+Ator組低于KO組，Tg+Ator組低于Tg組；其中KO+Ator組低于Ator組及Tg+Ator組，Tg+Ator組低于Ator組；說明他汀可降低ICAM-1的表達(dá)。HSP22基因缺失部分抑制他汀降ICAM-1表達(dá)的作用，過表達(dá)可促進(jìn)他汀降ICAM-1表達(dá)，兩者具有協(xié)同抗炎作用，進(jìn)一步改善AS進(jìn)展。

7 IL-6與HSP22的關(guān)系及他汀干預(yù)的影響

研究者用ELISA法定量檢測發(fā)現(xiàn)，AS病變區(qū)域中的IL-6和IL-8水平顯著高于正常內(nèi)膜；內(nèi)皮細(xì)胞功能測定顯示，AS病變區(qū)域內(nèi)皮活化程度亦顯著高于正常內(nèi)膜，表明IL-6及IL-8可能參與了AS早期炎癥及內(nèi)皮活化過程[23]。在本研究中，高脂飲食12周后，小鼠血清IL-6濃度在對(duì)照組、KO組及Tg組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明HSP22對(duì) IL-6釋放的調(diào)節(jié)作用不明顯；他汀干預(yù)8周后，小鼠血清IL-6在Ator組低于對(duì)照組，KO+Ator組低于KO組, Tg+Ator組低于Tg組，其中Ator組、KO+Ator組及Tg+Ator組血清IL-6水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明他汀干預(yù)可顯著降低血清中IL-6釋放，而HSP22可能不參與此過程。

本文結(jié)果提示，HSP22基因缺失可上調(diào)NF-κB和ICAM-1的表達(dá)，降低eNOS的表達(dá)，加速AS的進(jìn)展，HSP22基因過表達(dá)可降低NF-κB和ICAM-1的表達(dá)，升高eNOS的表達(dá)，從而改善AS。高脂飲食上調(diào)NF-κB、ICAM-1和IL-6的表達(dá)，下調(diào)eNOS表達(dá)，誘導(dǎo)AS形成，他汀可上調(diào)eNOS的表達(dá)，下調(diào)NF-κB、IL-6和ICAM-1的表達(dá)，改善AS。HSP22基因缺失部分限制了他汀下調(diào)NF-κB及ICAM-1、上調(diào)eNOS表達(dá)的作用，其過表達(dá)可促進(jìn)他汀下調(diào)ICAM-1表達(dá)，進(jìn)一步改善AS。但因本實(shí)驗(yàn)為觀察性研究，主動(dòng)脈HSP22蛋白作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)汀干預(yù)會(huì)影響胞外血清中HSP22濃度這一現(xiàn)象，后續(xù)研究應(yīng)深入探討血清HSP22濃度變化的機(jī)制及其對(duì)血管AS病變的影響。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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